HDGF和VEGF在胃癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系

周 強(qiáng) 何 慶

（樂山市第二人民醫(yī)院普外科，四川 樂山 614000）

HDGF和VEGF在胃癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤血管生成的關(guān)系

周 強(qiáng) 何 慶

（樂山市第二人民醫(yī)院普外科，四川 樂山 614000）

目的探討肝癌衍生生長因子(HDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤組織微血管密度（MVD）之間的關(guān)系和臨床意義。方法通過免疫組化SP法檢測83例胃癌組織、35例正常胃組織中HDGF、VEGF和CD105標(biāo)記的MVD表達(dá)情況，分析它們與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果HDGF、VEGF在胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別為：66.1%和80.7%，明顯高于正常對照組的陽性表達(dá)率17.1%和11.4%(P＜0.05)，胃癌組織中的MVD值為：（33.56±7.59）明顯高于常對照組（10.7±3.8 ）（P＜0.05）。HDGF、VEGF的表達(dá)強(qiáng)度以及MVD值和腫瘤浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性(P＜0.05)。兩者在胃癌組織中的表達(dá)存在著正相關(guān)(P＜0.05)。HDGF、VEGF陽性表達(dá)胃癌組織的MVD值明顯高于陰性表達(dá)的MVD值(P＜0.05)。結(jié)論HDGF、VEGF的過表達(dá)和微血管生成可能與腫瘤的發(fā)生和惡性行為有關(guān)，檢測該指標(biāo)對預(yù)測胃癌的預(yù)后和指導(dǎo)治療有一定的參考價(jià)值。

肝癌衍生生長因子；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度；免疫組化法；胃癌

胃癌是我國高發(fā)腫瘤，病死率占我國惡性腫瘤第一位，對患者的生命健康造成了很大的危害。胃癌的發(fā)生是涉及多基因的復(fù)雜過程，研究發(fā)現(xiàn)多種因子參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，因此，深入研究與胃癌有關(guān)的基因及其在胃癌中的作用機(jī)制，對胃癌的早期診斷、早期治療及預(yù)后判斷具有重要意義。肝癌衍生生長因子是1994年Nakamura等[1]從人肝癌細(xì)胞系HuH-7培養(yǎng)的細(xì)胞液中分離提純到的一種新的細(xì)胞增長因子。相關(guān)研究表明HDGF在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胰腺癌、食道癌等[2-8]，并且與腫瘤的生長浸潤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤的血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移的重要影響因素。在腫瘤的血管生成中VEGF起著關(guān)鍵作用，血管內(nèi)皮生長因子是目前所知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子，腫瘤血管生成能力是由微血管密度測定的。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測胃癌組織中HDGF、VEGF蛋白表達(dá)，并用抗-CD34抗體標(biāo)記腫瘤組織MVD，探討胃癌組織中HDGF和VEGF的表達(dá)與胃癌血管形成的關(guān)系，并討論其意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取四川省樂市第二人民醫(yī)院2006年1月至2012年3月手術(shù)切除的83例胃癌。受檢者術(shù)前均未接受化療、放療及生物調(diào)節(jié)治療等，所有標(biāo)本經(jīng)病理組織學(xué)切片證實(shí)。其中男性53例，女性30例；年齡43～67(53.4±6.2)歲。年齡：≥50歲者63例，＜50歲者20例；高-中分化者41例，低-未分化者42例；T1～T2 46例，T3～T4 37例；腫瘤＜3cm的30例，≥3cm的53例；淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的36例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的47例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ期以上33例。取35例良性病變胃大部分標(biāo)本的正常胃組織作為陰性對照組。

1.2 主要試劑

HDGF兔抗人多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)（bs-6537R），一抗工作液濃度1∶100。鼠抗人VEGF單克隆抗體（即用液）、鼠抗人CD34單克隆抗體（即用液）、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化SP法存檔石蠟組織行4μm厚切片，常規(guī)脫蠟，梯度酒精脫水，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷10min，高壓抗原修復(fù)，HDGF 單克隆抗體37℃孵育60min后4℃過夜，二抗孵育45min，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶孵育45min，DAB顯色5～10min，蘇木素復(fù)染后脫水、透明，封固后光鏡下觀察。HDGF用血管內(nèi)皮細(xì)胞的核染色作為陽性對照。VEGF和CD34染色用已知陽性片作陽性對照，PBS分別代替HDGF、VEGF、CD34單克隆抗體作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

圖1 HDGF在胃癌細(xì)胞核和細(xì)胞漿中的陽性表達(dá)SP×200

表1 正常胃組織和胃癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)以及MVD的比較

表2 胃癌HDGF和VEGF表達(dá)以及MVD和臨床病理參數(shù)的關(guān)系

所有切片均有兩名病理科高年資醫(yī)師在盲法原則下進(jìn)行評估：HDGF染色主要位于細(xì)胞核，以血管內(nèi)皮細(xì)胞的核染色作為內(nèi)對照和強(qiáng)度評分依據(jù)。VEGF染色主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，均以出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒為陽性細(xì)胞。以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞的百分比的乘積作為定性標(biāo)準(zhǔn)。染色強(qiáng)度：0分為無色；1分為：黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色(深淺與背景色相對比)。陽性細(xì)胞所 占的百分比：1分為陽性細(xì)胞≤10%；2分為陽性細(xì)胞11%～50%；3分為51%～75%；4分為＞76%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞所占的百分比的乘積0～3分為陰性(-)；＞3分為陽性。MVD評分方法：采用Weidner等報(bào)道的計(jì)數(shù)方法，首先在低倍鏡下(×100)選取微血管密度最高的3個(gè)區(qū)域即熱點(diǎn)(hotspot)，再在每一個(gè)區(qū)域的高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)微血管數(shù)(與毗鄰微血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織不相連的任何棕色染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞均作為一個(gè)獨(dú)立的微血管計(jì)數(shù))；取3個(gè)區(qū)域的均值為該組織的MVD以均數(shù)為分界分為陰性和陽性[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，HDGF和VEGF之間的關(guān)系用Spearman相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HDGF和VEGF在胃癌組織與正常胃組織中的表達(dá)與MVD

HDGF主要表達(dá)于細(xì)胞核中，細(xì)胞漿有部分表達(dá)，VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞漿中（圖1、2）。胃癌組織和正常胃黏膜組織中HDGF陽性表達(dá)率分別為：66.1%和17.1%。二者之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。VEGF陽性表達(dá)率分別為：11.4%和80.7%。二者之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CD34主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上（圖3），以CD34標(biāo)記的MVD值在正常胃組織和胃癌組織中分別為：（10.7± 3.81）和（33.56±7.59）。二者之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.2 胃癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)以及MVD與臨床病理因素之間的關(guān)系

胃癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)與MVD均與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），而均與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P＜0.05)。見表2。

2.3 胃癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)的相關(guān)性

在54例HDGF陽性的胃癌組織中，VEGF陽性者51例，占94.4%，29例HDGF陰性胃癌組織中，VEGF 陽性者16例，占55.17%，r＝0.475，P＜0.05，經(jīng)Spearman分析，胃組織中HDGF和VEGF表達(dá)呈正相關(guān)。見表3。

表3 胃癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)的相關(guān)性

2.4 胃癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系

HDGF陰性表達(dá)組MVD為（28.55±7.61），HDGF陽性表達(dá)組MVD為（36.26±6.11），（t=-5.022，P＜0.05），二者之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VEGF陰性表達(dá)組MVD為（23.79±5.13），VEGF陽性表達(dá)組MVD為（35.90±6.07），t=-7.360（P＜0.001），二者之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 胃癌組織中HDGF和VEGF表達(dá)與MVD的關(guān)系

3 討 論

HDGF最初是從人肝癌細(xì)胞株HuH-7培養(yǎng)液中純化的一種酸性肝素結(jié)合蛋白。在多種組織器官均有表達(dá)，如肝臟、心臟、肺臟、骨骼肌、胎盤等，主要在多種組織器官發(fā)育的早期階段出現(xiàn)，隨著細(xì)胞的分化成熟，其表達(dá)水平會(huì)逐漸降低。HDGF可以通過自分泌和旁分泌在細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)相關(guān)基因的啟動(dòng)和表達(dá)。HDGF具有促進(jìn)細(xì)胞增殖[10]、促進(jìn)血管的生成[10]、抑制細(xì)胞凋亡[11]、參與創(chuàng)傷修復(fù)[12]等生物學(xué)功能。大量研究表明HDGF與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，它在多種腫瘤細(xì)胞系以及多種腫瘤組織中高表達(dá)。HDGF參與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移，其過表達(dá)是腫瘤患者預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)[2,5,13]。本研究使用免疫組化SP法檢測了胃癌組織和正常胃組織中HDGF蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示胃癌組織中的HDGF表達(dá)明顯高于正常對照組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他類型的惡性腫瘤相似，說明HDGF在多種惡性腫瘤中可能存在高表達(dá)，HDGF與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。Mao等[14]研究結(jié)果顯示HDGF的表達(dá)隨著胃黏膜的癌變進(jìn)程逐漸升高，并與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、UICC分期相關(guān)。Yamamoto等[3]研究顯示，HDGF表達(dá)水平與胃癌血管、淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及無瘤生存期密切相關(guān)。我們的研究分析了HDGF表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HDGF陽性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。與相關(guān)的研究結(jié)果基本一致，提示HDGF陽性表達(dá)與胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性有關(guān)。

腫瘤的血管生成是腫瘤生長轉(zhuǎn)移中最基本的因素，腫瘤血管為腫瘤組織提供新陳代謝所必需的氧氣和營養(yǎng)，從而使腫瘤得以迅速的生長并同時(shí)為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)Folkman的理論：腫瘤生長分為兩個(gè)階段，第一個(gè)階段是血管前期，腫瘤無血供，腫瘤大小在1～2mm之間，該階段僅靠彌散獲取營養(yǎng)，腫瘤處于靜息期。第二個(gè)階段為血管期，在該階段內(nèi)，腫瘤的繼續(xù)生長需要腫瘤新生血管的形成才能夠提供足夠的營養(yǎng)和氧氣。在該階段內(nèi)VEGF起著關(guān)鍵的作用。腫瘤細(xì)胞分泌大量VEGF，促使腫瘤血管生成，使腫瘤迅速生長并可發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。VEGF又稱血管通透性因子(vascular permeability factor，VPF)，為分子量34～45kD的同源二聚體糖蛋白。VEGF通過旁分泌機(jī)制作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)受體發(fā)揮重要作用。VEGF促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制有：①特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、遷移進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成。②加快基底膜降解、增強(qiáng)血管壁的通透性，以利于癌細(xì)胞進(jìn)入血管腔或向鄰近的纖維蛋白和結(jié)締組織基質(zhì)擴(kuò)散，為腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。③作用于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)淋巴管形成，有利于腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移；④作用于免疫細(xì)胞，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。大量研究顯示VEGF與大多數(shù)實(shí)體腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、病理分級和預(yù)后等密切相關(guān)。惡性腫瘤血管生成數(shù)量測定的金標(biāo)準(zhǔn)是微血管密度[15]。多數(shù)學(xué)者證實(shí)了MVD與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，認(rèn)為MVD是反映惡性腫瘤生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。并通過實(shí)驗(yàn)揭示了MVD與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究顯示胃癌組織中VEGF表達(dá)水平以及MVD值明顯高于正常組織（P＜0.05），說明腫瘤的血管生成為腫瘤的生長提供了必需的氧氣及營養(yǎng)，從而可以促進(jìn)腫瘤的繼續(xù)發(fā)展。本研究中VEGF陽性表達(dá)的MVD值高于VEGF陰性表達(dá)的MVD值（P＜0.05），更進(jìn)一步印證了VEGF在腫瘤血管生成中的重要作用。進(jìn)一步分析了VEGF陽性表達(dá)和MVD值與胃癌臨床病理因素的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)VEGF陽性表達(dá)和MVD值與腫瘤患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤浸潤深度、腫瘤大小、臨床分期有關(guān)（P＜0.05），試驗(yàn)結(jié)果與大部分相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似，說明腫瘤血管生成與胃癌發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示在胃癌組織中HDGF陽性表達(dá)的MVD值高于HDGF陰性表達(dá)的MVD值（P＜0.05），說明HDGF參與了胃癌的微血管生成。HDGF表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.475，P＜0.05），說明兩者在胃癌血管生成中可能存在某種相互調(diào)節(jié)機(jī)制。Okuday等[10]研究發(fā)現(xiàn)HDGF在促進(jìn)血管生成的同時(shí)能檢測到VEGF的基因轉(zhuǎn)錄活性也明顯增強(qiáng)，組織中VEGF的表達(dá)也明顯增高，“外源性”VEGF可明顯抑制HDGF的表達(dá)，說明HDGF可能通過誘導(dǎo)VEGF的生成而參與腫瘤血管的生成調(diào)節(jié)。Everett等[16]的研究顯示HDGF在促進(jìn)血管生成方面與VEGF不同，HDGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移從而促進(jìn)血管形成的能力。

綜上所述，HDGF和VEGF的高表達(dá)以及腫瘤微血管生成可能在胃癌的發(fā)生及侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。二者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和血管生成中可能起相互協(xié)調(diào)作用。HDGF和VEGF有望成為治療胃癌的靶點(diǎn)，靶向HDGF和VEGF有可能抑制胃癌的血管生成，從而抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，提高胃癌患者的療效。但是HDGF誘導(dǎo)VEGF生成的詳細(xì)過程仍不清楚，而且對于HDGF是否可以作為VEGF的上游調(diào)節(jié)因子尚需進(jìn)一步的研究。

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Relationship of HDGF and VEGF Expression with Gastric Cancer Angiogenesis

ZHOU Qiang, HE Qing

(Department of General Surgery, Leshan No.2 People’s Hospital, Leshan 614000, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of hepatoma-derived growth factor (HDGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) and microvessel density of gastric cancer and its significance.MethodsThe expressions of HDGF, VEGF and MVD in 83 cases of gastric cancer and 35 cases of normal gastric tissue were detected by SP immunohistochemical method, and then their correlations with clinicopathological characteristics were analyzed.ResultsPositive rates of HDGF (66.1%) and VEGF expressions (80.7%) were significantly higher in gastric cancer tissues than those in the normal gastric tissues (17.1% and 11.4% respectively, P＜0.05) and so did the MVD which was (33.56±7.59) in gastric cancer and (10.7±3.81) in the normal gastric tissues (P＜0.05). The expression of HDGF, VEGF and MVD were closely correlated to the invasive depth, lymph node metastasis and TNM staging of gastric cancer(P＜0.05). The expressions of HDGF were positively correlated with the expressions of VEGF (P＜0.05). The values of MVD in cases with positive expression of HDGF and VEGF were significantly higher than in cases with negative expression of them(P＜0.05).ConclusionOverexp ression of HDGF and VEGF and angiogenesis might contribute to the tumorigenesis and malignant behaviors of gastric cancer. Detecting the expression of HDGF, VEGF and MVD value probably can predict the prognosis of gastric cancer.

Hepatoma derived growth factor; Vascular endothelial growth factor; Microvessel density; Immunohistochemical method; Gastric cancer

R735.2

B

1671-8194（2013）12-0067-04