胃蛋白酶原光激化學(xué)發(fā)光免疫測定方法的建立

周 偉金 磊* 孟 偉高月求

（1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗科，上海 200021；2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細(xì)胞免疫實驗室，上海 200021）

胃蛋白酶原光激化學(xué)發(fā)光免疫測定方法的建立

周 偉1金 磊2* 孟 偉1高月求2

（1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗科，上海 200021；2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細(xì)胞免疫實驗室，上海 200021）

目的建立一種檢測人血清胃蛋白酶原濃度的光激化學(xué)發(fā)光免疫測定方法。方法采用雙抗體夾心法建立檢測人血清中胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ濃度的方法，評估其分析靈敏度、回收率和批內(nèi)精密度，并與雅培(化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行比較。結(jié)果胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ的分析靈敏度分別為0.8ng/mL和0.6ng/mL，回收率分別為100.3%、106.5%，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為0.93%～4.1%、1.2%～4.3%，與化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性較好(r=0.99)。結(jié)論該方法測定胃蛋白酶原具有較高靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性，適用于臨床。方法建立后可進(jìn)一步進(jìn)行長期穩(wěn)定性試驗。

胃蛋白酶原；光激化學(xué)發(fā)光免疫分析方法；微粒

胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是胃蛋白酶的無活性前體，分子量為42KDa左右，PG有7個同工酶，按其生化免疫特性可分為PGⅠ亞群和PGⅡ亞群。PGⅠ主要由胃底腺主細(xì)胞分泌，PGⅡ則由胃底腺、胃竇幽門腺、Brunner等腺分泌[1,2]，它們可以反映胃黏膜狀態(tài)和功能。PG大多釋放入胃并活化為胃蛋白酶，僅有約1%通過黏膜毛細(xì)血管進(jìn)入血循環(huán)，當(dāng)胃部有病理變化時，如胃炎、胃潰瘍等，血清PG的水平會發(fā)生相應(yīng)的變化，PG作為胃病篩查的體外檢測已越來越受到關(guān)注[3]。建立一種快速、靈敏的胃蛋白酶原測定方法是臨床研究人員關(guān)注的焦點。我們嘗試采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析方法[4](1ight initiated chemiluminescent assay，LICA)建立一種檢測胃蛋白酶原的方法，并對檢測性能進(jìn)行初步評價。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

抗PGⅠ單克隆抗體8003#和8009#，抗PGⅡ單克隆抗體8101#和8103#均購自Medix Biochemia公司。發(fā)光微粒由博陽生物科技(上海)有限公司提供。LICA通用液系LICA HT光激化學(xué)發(fā)光檢測儀的配套試劑。二奎啉甲酸(BCATM)法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。相關(guān)性分析樣本，來自于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院住院及門診病人新鮮血液，分離血清冷凍保存。LICA HT高通量均相發(fā)光免疫分析儀、LICA SP全自動移液器由上海博陽醫(yī)療儀器有限公司提供；粒徑儀為NICOMP380激光衍射式粒度分布測量儀。96孔微孔板為LICA HT高通量均相發(fā)光免疫分析儀配套專用板。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫發(fā)光微粒的制備

依照參考文獻(xiàn)[5]，取適量200nm左右表面為活性醛基的發(fā)光微粒2支，離心處理，超聲分散至0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)中，以10∶2(W/w)的比例分別加入單克隆抗體8003#和8101#，分別加入適量三氫硼氰化鈉(NaCNBH3)催化，37℃旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)48h，進(jìn)行離心，清洗未反應(yīng)的單抗，之后將其分別定容至10mg/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗體的生物素標(biāo)記

取適量單克隆抗體8009#和8103#，將其溶液的pH值調(diào)整為8.5，以1∶30(摩爾比)的比例加入生物素(Biotin)，4℃混合反應(yīng)過夜，之后將未反應(yīng)的生物素進(jìn)行透析處理，將其定容至1mg/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將兩份經(jīng)Abbott Architect系統(tǒng)定值的PGⅠ、PGⅡ混合樣本用分別小牛血清系列稀釋，配制成0、5、35、70、200、500ng/mL的PGI標(biāo)準(zhǔn)液和0、5、10、20、50、100ng/mL的 PGⅡ標(biāo)準(zhǔn)液。再使用Abbott Architect系統(tǒng)對每個稀釋液進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定合格后，分裝成每管1mL，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 檢測方法

在96孔微孔板中，每孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或者待測樣本25μL、免疫發(fā)光微粒試劑25μL、生物素標(biāo)記試劑25μL，將微孔板置于LICA HT光激化學(xué)發(fā)光檢測儀內(nèi)，儀器程序設(shè)定為37℃溫育1200s，然后儀器自動加入LICA通用液175μL，37℃溫育900s后，讀取光信號RLU值。

1.2.5 檢測方法性能評價

1.2.5.1 分析靈敏度

表2 LICA PGⅠ/PGⅡ的穩(wěn)定性

圖1 LICA同Abbott測定PGⅠ的相關(guān)圖

方法參考EP17-A[6]程序：質(zhì)控在控的情況下，同批試劑一次運行空白樣本或零值校準(zhǔn)品20次，計算均值及SD，以空白均值±2SD來計算方法的分析靈敏度。

1.2.5.2 回收率

待測樣本等體積分為3份，取2份分別以等體積與高低質(zhì)控品（QC H和QC L）等體積混合，分別測定待測樣本、混合后樣本、QC H和QC L各測3次，取均值，計算回收率?；厥章?實際檢測濃度/理論濃度×100%。

1.2.5.3 精密度

參考EP5-A2[7]程序：采用同一批試劑、校準(zhǔn)品，以各自配套的質(zhì)控血清作為測試標(biāo)本，一次運行對標(biāo)本重復(fù)測定至少20次。計算均值、SD及CV。

1.2.5.4 穩(wěn)定性

37℃加速穩(wěn)定性實驗，將試劑在37℃存放7d，然后對其進(jìn)行物理檢查，并在線性、靈敏度、精密度方面考察其穩(wěn)定性。

1.2.5.5 方法學(xué)相關(guān)性分析

取65份患者血清樣本，分別用建立的LICA和Abbott Architect試劑(化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行檢測，并對2種方法的檢測值進(jìn)行比較，得到相關(guān)性曲線。

2 結(jié) 果

2.1 分析靈敏度

光激化學(xué)發(fā)光法PGⅠ、PGⅡ試劑盒的分析靈敏度分別為0.8ng/mL和0.6ng/mL。

2.2 批內(nèi)精密度

光激化學(xué)發(fā)光法PGⅠ、PGⅡ試劑盒QC L的批內(nèi)精密度分別為4.1%和4.3%，QC H的批內(nèi)精密度分別為0.93%和1.2%。

2.3 回收率

樣本與QC L等體積混合后的樣本為樣本1，與QC H等體積混合后的樣本為樣本2，回收率=實際檢測濃度/理論濃度×100%。結(jié)果見表1。

2.4 穩(wěn)定性

將37℃存放7d的試劑取出，對其進(jìn)行物理檢查，并考察試劑的線性、靈敏度、精密度，結(jié)果見表2。

2.5 與化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果的相關(guān)性

圖2 LICA同Abbott測定PGⅡ的相關(guān)圖

表1 LICA PGⅠ/PGⅡ的回收率

分別用LICA法和Abbott化學(xué)發(fā)光法檢測65份患者血清樣本的PGⅠ和 PGⅡ的濃度，相關(guān)結(jié)果見圖1和圖2，相關(guān)性方程分別為YPGI=1.004XPGI-0.147，r=0.977；YPGII=0.885XPGII+2.311，r=0.951；對二相關(guān)系數(shù)做統(tǒng)計分析，r＞r0.05(63)，P＜0.05，說明相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計意義。

3 討 論

已有報道證實[8,9]，血清胃蛋白酶原的水平可動態(tài)地反映胃黏膜的狀態(tài)和組織功能：在發(fā)生基底腺黏膜萎縮性胃炎時，會伴隨著血清PGⅠ含量的顯著下降，PGⅠ/PGⅡ的比值降低，這提示了胃癌的可能；在胃潰瘍時，PGⅠ會異常增高；比較潰瘍組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組和正常組的PGⅠ值和PGⅠ/PGⅡ值，其大小順序如下：潰瘍組＞正常組＞萎縮性胃炎組＞胃癌組。由于PGⅠ、PGⅡ檢測成本相對低廉且操作簡便，適合大批量的標(biāo)本檢測，對胃黏膜疾病的大規(guī)模篩查具有實用價值，因此可作為慢性萎縮性胃炎的胃黏膜萎縮程度篩查指征。

對PG的檢測目前已經(jīng)報道的方法有免疫比濁分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析等，但這些方法分別存在敏感性差、定量范圍窄、需要反復(fù)清洗與分離、檢測耗時長、自動化程度不高等缺點。光激化學(xué)發(fā)光是繼LOCI[10]（Luminescent oxygen channeling immunoassay）技術(shù)問世之后，在國內(nèi)建立、發(fā)展并應(yīng)用于臨床檢測的一種新型檢測技術(shù)。在均相條件下將內(nèi)部帶有染料的LICA通用液微粒以及包被有活性分子并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微?；旌衔锖蜋z測樣本混合。此時LICA通用液微粒和包被有活性分子的發(fā)光微粒可迅速有效地捕捉靶分子并形成免疫夾心復(fù)合物。經(jīng)680nm激發(fā)光照射后，LICA通用液微粒中的染料被誘導(dǎo)激活，并釋放高能態(tài)的單線態(tài)活性氧。該高能態(tài)的活性氧被近距離的發(fā)光微粒俘獲，傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級610nm紅光，用光子計數(shù)器計數(shù)得到相對光量子單位(RLU)值。該法反應(yīng)為均相反應(yīng)，既可加快反應(yīng)速度，又可避免反復(fù)分離與清洗，同時，由于微粒表面積的增加，也提高了檢測的靈敏度。

本研究采用LICA的雙抗體夾心法，建立了測定PGⅠ和PGⅡ的方法，并考察了分析性能。結(jié)果表明，LICA法測定PGI和PGII的本底低、靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、分析時間短(僅為25min)。在37℃ 7d的加速穩(wěn)定性實驗中，試劑的外觀目測無沉淀，粒徑分布均一，在線性、靈敏度、精密度方面也和4度試劑無明顯差異，試劑的穩(wěn)定性佳。

LICA測定PGⅠ和PGⅡ的分析靈敏度分別為0.8ng/mL和0.6ng/mL，同市場上同類產(chǎn)品雅培的靈敏度1ng/mL和0.5ng/mL近似；本法的回收率高，在90%～110%之間；質(zhì)控血清的批內(nèi)和批間CV均＜5%，具有很好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，與化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性好，可適用于臨床。該方法的建立有助于進(jìn)一步進(jìn)行長期穩(wěn)定性試驗和相應(yīng)的檢測試劑盒的研制。

[1] Samloff IM.Cellular localization of group I pepsinogens in human gastric mucosa by immunofluorescence[J].Gastroenterology,1971, 61(2):185-188.

[2] Samloff IM,Liebman WM (1973).Cellular localization of the group II pepsinogens in human stomach and duodenum by immunofluorescence[J].Gastroenterology,1973,65(1):36-42.

[3] 孫麗萍,袁嬡.胃蛋白酶原含量檢測及其在胃疾病診治中的應(yīng)用[J].世界華人消化雜志,2001,9(10):1174-1176.

[4] 高云朝.光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2009,32(4):474-476.

[5] Hermanson GT.Bioconjugate Techniques[M].2nd ed.Anaheim: Academic Press,2008:890-892.

[6] Clinical and Laboratory Standards Institute (Formerly NCCLS). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline-Second Edition [S].EP17-A, NCCLS,2004.

[7] Clinical and Laboratory Standards Institute (Formerly NCCLS). Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods[S].EP5-A2,NCCLS,2004.

[8] 吳志成,何敏,夏勇.血清胃蛋白酶原檢測與慢性萎縮性胃炎相關(guān)研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,31(13):2027-2028.

[9] 姜智敏,戈之錚.胃蛋白酶原在慢性萎縮性胃炎和胃癌篩查中的價值[J].胃腸病學(xué),2009,14(12):754-756.

[10] Ullman EF,Singh S,Wu ZP,et al.Luminescent oxygen channeling immunoassay: Measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(6): 5426-5430.

Quantitative Determination of Pepsinogen Using the Light Initiated Chemiluminescent Immunoassay

ZHOU Wei1, JIN Lei2, MENG Wei1, GAO Yue-qiu2

(1 Department of Laboratory, the Affiliated Shuguang Hospital of Shanghai TCM University, Shanghai 200021, China; 2 Cellular Immune Laboratory, the Affiliated Shuguang Hospital of Shanghai TCM University, Shanghai 200021, China)

ObjectiveTo develop a light initiated chemiluminescent immunoassay for human pepsinogen.MethodsDouble antibody sandwich immunoassay was used to develop to detect the concentrations of pepsinogen Ⅰ and pepsinogen Ⅱ in human sera respectively. Analytical sensitivity, recovery and within-run precision were evaluated and the results were compared with Abbott reagent(chemiluminescent immunoassay).ResultsThe analytical sensitivity of pepsinogen Ⅰ and pepsinogen Ⅱ were 0.8ng/mL and 0.6ng/mL, recovery of PGⅠ and PGⅡ were 100.3%, 106.5%, within-run precision were 0.93%-4.1%、1.2%-4.3%. The coincidence rate with the chemiluminescent immunoassay was highly significant (r=0.99).ConclusionsThe light initiated chemiluminescent immunoassay for pepsinogen have good sensitivity, precision, accuracy, and can be applied for clinical determination. It will be helpful to carry on the long-term stability test.

Pepsinogen; Light initiated chemilumineseent immunoassay; Microsphere

R446.6

B

1671-8194（2013）12-0064-03

*通訊作者