吡格列酮對動脈粥樣硬化兔CD40-CD40L系統(tǒng)的影響

李華偉 薛 凌* 高夏青

（盤錦市中心醫(yī)院消化二科，遼寧 盤錦 124000）

吡格列酮對動脈粥樣硬化兔CD40-CD40L系統(tǒng)的影響

李華偉 薛 凌* 高夏青

（盤錦市中心醫(yī)院消化二科，遼寧 盤錦 124000）

目的 通過觀察吡格列酮對動脈粥樣硬化（AS）兔血脂、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平及斑塊/內(nèi)膜面積比以及斑塊部位炎癥細(xì)胞CD40表達(dá)的影響，探討吡格列酮與CD40-CD40L系統(tǒng)相互作用機(jī)制以及其對兔動脈粥樣硬化的影響。方法 雄性日本大耳白兔，隨機(jī)分為4組，每組10只。A組（正常對照組）：普通顆粒飼料喂飼；B組：（高脂模型組）高脂飼料喂飼；C組（高脂模型吡格列酮低劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮1mg/（kg·d）灌胃；D組（高脂模型吡格列酮高劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮2mg/（kg·d）灌胃，共16周。在飼養(yǎng)開始前及結(jié)束后檢測如下指標(biāo)：①血脂；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察：②血清hsCRP；③sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L；④斑塊/內(nèi)膜面積比；⑤免疫組織化學(xué)法測定斑塊部位巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞CD40的表達(dá)。結(jié)果 飼養(yǎng)開始前B、C、D組與A組比較，血脂水平無顯著性差異，16周后，B、C、D組血脂水平與A組比較均顯著升高（P＜0.01）；C、D組血清hsCRP水平顯著低于B組（P＜0.01）；C、D組sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論 吡格列酮有抑制動脈粥樣硬化斑塊形成和血管內(nèi)皮保護(hù)功能，而這些功能可能與其阻CD40-CD40L系統(tǒng)有關(guān)。

動脈粥樣硬化；吡格列酮；CD40-CD40L系統(tǒng)

動脈粥樣硬化（AS）所致的心腦血管疾病是當(dāng)今世界的首要死亡原因。粥樣硬化病變是動脈對內(nèi)膜損傷作出的炎癥-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果，已有研究表明CD40-CD40L系統(tǒng)作用貫穿了AS斑塊發(fā)生、發(fā)展和破裂的全過程。吡格列酮（PIO）是噻唑烷二酮類（TZDs）藥物，它通過活化PPAR-γ進(jìn)而抑制各種信號通路的傳導(dǎo)達(dá)到抑制炎癥因子基因啟動子激活和轉(zhuǎn)錄的目的。本研究旨在觀察吡格列酮對CD40-CD40L系統(tǒng)及動脈粥樣硬化兔的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：膽固醇（北京邦定生物制藥有限公司）；sCD40L、sVCAM-1、sICAM-1 試劑盒（七海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品）；High-SABC試劑盒（武漢博士得生物工程有限公司）。儀器：全自動生化分析儀；OLYMPUS CH20型光學(xué)顯微鏡；CIAS-1000圖像分析儀等。

表1 各組實(shí)驗(yàn)前后TC、TG、LDL-C和HDL-C（mmol/L）在家兔血清的變化（）

表1 各組實(shí)驗(yàn)前后TC、TG、LDL-C和HDL-C（mmol/L）在家兔血清的變化（）

注：與自身0周時相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01

組別TCTGLDL-CHDL-C 0周16周0周16周0周16周0周16周A組1.31±0.331.35±0.251.23±0.510.87±0.210.61±0.320.71±0.110.49±0.120.88±0.12 B組1.35±0.2425.81±11.32##**1.39±0.282.87±1.22#*0.57±0.1914.53±9.82##**0.53±0.276.3±1.5##** C組1.28±0.1219.54±5.5##**0.97±0.141.02±1.83*0.62±0.137.3±2.85##**0.67±0.323.7±1.2##** D組1.29±0.3720.32±10.8##**1.08±0.332.42±1.33#*0.45±0.216.89±2.47##**0.74±0.342.9±1.4##**

1.1.2 動物：健康雄性日本大耳白兔40只，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，兔齡3～4個月，體重（2.0±0.15）kg，單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立：健康雄性日本大耳白兔40只，隨機(jī)分為四組，每組10只。A組（正常對照組）：普通顆粒飼料喂飼；B組：（高脂模型組）高脂飼料喂飼；C組（高脂模型吡格列酮低劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮3mg/（kg·d）灌胃；D組（高脂模型吡格列酮高劑量組）：高脂飼料喂飼同時給予吡格列酮6mg/（kg·d）灌胃，自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)16周。

1.2.2 標(biāo)本留?。簩?shí)驗(yàn)開始前、結(jié)束時（16周末），空腹12h，在兔耳緣靜脈取血用于檢測。于16周末用氣體栓塞法處死動物，無菌操作條件下取出主動脈，置入10%甲醛液固定后，油紅O染色后攝像，AS斑塊最明顯處標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，制作HE染色病理切片及免疫組化病理切片。

1.2.3 血脂檢測：采用酶法測定血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.2.4 血清hsCRP、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L檢測：分別取血清，采用ELISA法的檢測血清hsCRP、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L。

1.2.5 斑塊/內(nèi)膜面積比：將油紅O染色相片輸入HM IAS22000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，測量距主動脈弓4cm內(nèi)主動脈斑塊面積及內(nèi)膜面積，計(jì)算面積比。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法觀察CD40-CD40L在斑塊及血管內(nèi)皮的表達(dá)：按High-SABC法進(jìn)行操作，DAB染色，蘇木素復(fù)染，胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；以PBS代替一抗作陰性對照。在10×40倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)取10 個視野，細(xì)胞無特異性染色（呈淺藍(lán)）為“-”，輕度特異性染色即弱陽性（淺黃色）為“+”，中度特異性染色即陽性（棕黃色）為“++”，明顯特異性染色即強(qiáng)陽性（深棕色或黑色）為“+++”。

2 結(jié) 果

2.1 血脂檢測

實(shí)驗(yàn)前各組血脂均無顯著性差異。16周末，B、C、D組與A組相比，TC、TG、HDL-C和LDL-C均顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表2 血清hsCRP（mg/L）、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L（ng/L）指標(biāo)檢測結(jié)果（）

表2 血清hsCRP（mg/L）、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L（ng/L）指標(biāo)檢測結(jié)果（）

注：與B組相比，★★P＜0.01

組別hsCRPsVCAM-1sICAM-1sCD40L A組0.407±0.3041.23±0.2635.42±4.330.49±0.13 B組1.532±0.1835.32±0.48116.54±23.757.93±1.65 C組1.402±0.152★★4.36±0.82★★82.74±13.69★★3.41±0.82★★D組1.205±0.145★★4.05±0.93★★0.33±14.72★★2.98±0.44★★

2.2 血清hsCRP、sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L檢測

16周末時，C、D組血清hsCRP水平顯著低于B組（P＜0.01）；C、D組sVCAM-1、sICAM-1、sCD40L水平顯著降低（P＜0.01），結(jié)果見表2。

3 討 論

AS是一種多因素作用的慢性炎癥性疾病，近年研究表明CD40廣泛表達(dá)于AS斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、T細(xì)胞等，其作用幾乎貫穿了AS斑塊發(fā)生、發(fā)展和破裂的全過程，抑制CD40在炎癥細(xì)胞的表達(dá)可能會在AS防治中起到重要作用。吡格列酮是PPAR-γ激動劑，PPAR-γ激活后抑制超氧離子的產(chǎn)生及與氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子如NF--kappaB等相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子[1,2]，進(jìn)而抑制炎癥因子靶基因的活化與轉(zhuǎn)錄。ICAM-1和VCAM-1是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附作用的膜表面糖蛋白，它由CD40-CD40L系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且與動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單純高脂飼料喂養(yǎng)相比，吡格列酮灌胃組兔sCD40L水平顯著降低，相應(yīng)的sVCAM-1、sICAM-1水平也顯著降低。免疫組織化學(xué)法定位顯示CD40、CD40L在斑塊部位炎癥細(xì)胞上表達(dá)顯著減少，同時HE染色切片觀察發(fā)現(xiàn)，吡格列酮組兔主動脈內(nèi)膜病理改變與模型組相比顯著減輕[4-6]。這說明，吡格列酮可以抑制動脈粥樣斑塊形成，保護(hù)血管內(nèi)皮，而這些作用的可能機(jī)制是它抑制了動脈粥樣硬化發(fā)展過程中CD40-CD40L在炎癥細(xì)胞的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究探討吡格列酮阻斷CD40-CD40L系統(tǒng)干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展，為AS臨床治療 提供新的靶點(diǎn)，同時擴(kuò)展吡格列酮在臨床上的應(yīng)用，為臨床防治動脈硬化提供新的思路。

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R541.4

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1671-8194（2013）25-0074-02

*通訊作者：E-mail:lysyxueling@163.com