擴張型心肌病大鼠心功能減弱與SIRT1表達下調(diào)有關(guān)

劉 杜周乾毅李小晶張淑娟朱 磊趙運海袁新初袁 瓊*

（1 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖北 武漢 430081；2 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，湖北 武漢 430081；3 武漢科技大學(xué)天佑醫(yī)院超聲影像科，湖北 武漢 430000）

擴張型心肌病大鼠心功能減弱與SIRT1表達下調(diào)有關(guān)

劉 杜1周乾毅2李小晶3張淑娟1朱 磊1趙運海1袁新初2袁 瓊1*

（1 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖北 武漢 430081；2 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，湖北 武漢 430081；3 武漢科技大學(xué)天佑醫(yī)院超聲影像科，湖北 武漢 430000）

目的 探討SIRT1在擴張型心肌病（DCM）大鼠心肌中的表達及其意義。方法 采用腹腔注射阿霉素8周建立大鼠DCM模型，彩色多普勒檢測大鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能，采用免疫組織化學(xué)方法及Western blot技術(shù)檢測心肌組織中SIRT1蛋白表達水平。結(jié)果 與正常組相比，DCM組大鼠左室舒張期末徑和左室收縮期末徑均明顯增大，左室射血分數(shù)明顯下降；DCM大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達水平明顯下調(diào)。結(jié)論 SIRT1在DCM心肌中表達下調(diào)，提示其與DCM的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。

擴張型心肌病；SIRT1

擴張型心肌?。―CM）是以左心室擴張和收縮功能減退為特征的一種慢性充血性心衰疾病。其病理特征為心肌細胞壞死、纖維化、膠原增生。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是尼克酰胺依賴性（NAD+）組蛋白去乙?；福哂醒泳徦ダ?、調(diào)節(jié)能量代謝、抗氧化應(yīng)激等多種生物功能[1-3]。研究證實，SIRT1具備心臟保護功能。在大鼠心衰模型中發(fā)現(xiàn)SIRT1參與抑制心臟衰老并增加其抵抗氧化應(yīng)激能力[4,5]。在糖尿病大鼠模型中SIRT1的激動劑白藜蘆醇上調(diào)胞漿鈣通道相關(guān)ATP（SERCA2），改善糖尿病時心臟收縮能力,且SIRT1參與該作用[6]。研究人員在體外培養(yǎng)的心肌細胞實驗中證實，SIRT1能通過與過氧化物酶增殖激動受體α（PPAR-α）作用，保護心肌細胞，抑制其肥大、代謝紊亂及驗證反應(yīng)[7]。因此，我們推測DCM的發(fā)生與發(fā)展與SIRT1表達降低有關(guān)。本研究通過腹腔注射阿霉素建立大鼠DCM模型，DCM的發(fā)生與發(fā)展與SIRT1之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要藥物、試劑：7周齡SD雄性大鼠18只，體質(zhì)量（62.5±4.5）g，武漢大學(xué)實驗動物中心提供。阿霉素購于美國Sigma公司，胞核胞漿抽提試劑盒購于北京博奧森生物公司，SIRT1、α-tubulin、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗均購于美國Santa Cruze公司，S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物有限公司，DMR+Q550病理圖像分析儀購于德國萊卡公司。

1.2 DCM大鼠動物模型建立：將SD大鼠隨機分為正常組（n=9）和DCM組（n=9），DCM組大鼠腹腔注射阿霉素2mg/（kg·周），正常組大鼠腹腔注射生理鹽水，連續(xù)8周用藥。

1.3 彩色多普勒超聲檢查：于第8周末對所有大鼠行彩色多普勒超聲。記錄大鼠左室舒張期末徑（LVDD）、左室收縮期末徑（LVDS）和左室射血分數(shù)（LVEF）。

1.4 免疫組化SP法檢測SIRT1蛋白表達：造模結(jié)束后處死大鼠，剪取部分心肌組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用SP法嚴格按照說明書操作檢測SIRT1蛋白表達，SIRT1一抗稀釋度為1∶200，檸檬酸抗原熱修復(fù)，DAB顯色，PBS代替一抗做陰性對照。在圖像分析儀上，每個切片隨機取5個高倍視野，測定一定面積內(nèi)陽性信號面積和陽性信號平均灰度值，計算陽性信號指數(shù)，5個視野陽性信號指數(shù)的平均值為最終陽性信號指數(shù)，陽性信號判定標(biāo)準(zhǔn)：SIRT1陽性染色主要集中在細胞核，呈現(xiàn)淺黃色至深棕色。

1.5 Western blot檢測SIRT1蛋白表達：大鼠處死后取部分心肌組織，剪碎，按照胞漿胞核抽提試劑盒說明書抽提胞核胞漿蛋白。分別灌注8%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠。樣品上樣后4℃電泳，先以90v電泳至樣品Lane前沿達分離膠界面時改為120v，至溴酚藍指示劑離SDSPAGE膠底部約1cm處結(jié)束電泳。電泳后將膠起出，用電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%BSA的TBST室溫封閉1h，一抗（rabbit—anti SIRT1抗體，1∶2000稀釋，mouse-anti α-tubulin抗體，1∶2000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜后，二抗（HRP-anti rabbit IgG，1∶2000稀釋；HRP-anti mouse IgG，1∶2000稀釋）于室溫孵育lh，再次洗膜后，按ECL顯色試劑盒說明書操作顯色。暗室里X線片曝光，灰度分析測定顯色面積和灰度。

圖1 彩色多普勒檢測擴張型心肌病大鼠心功能代表性圖片

圖2 免疫組化檢測擴張型心肌病大鼠心臟SIRT1蛋白表達代表性圖片（400x）

1.6 統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異采用Student t檢驗，雙側(cè)P＜0.05，認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心臟LVDD、LVDS和LVEF的改變

與正常組相比，DCM組大鼠的LVDD和LVDS明顯增大（5.88mm ±0.45mm vs7.01mm±0.73mm，2.85mm±0.49mm vs 3.93mm± 0.34mm），LVEF明顯降低（83.77%±4.05% vs 67.77%±4.76%）（P＜0.01）。如圖1。

2.2 免疫組化檢測SIRT1蛋白表達

SP法免疫組化結(jié)果顯示SIRT1陽性染色主要集中在心肌細胞核，呈淺黃色至深棕色。與正常組大鼠心肌組織相比，DCM組陽性細胞顯著減少，如圖2。

2.3 Western blot檢測SIRT1蛋白表達

與正常對照組相比，DCM組大鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達明顯降低（1.61±0.39 vs 0.93±0.26），有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。該結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。

3 討 論

研究人員認為DCM主要由遺傳因素和病毒感染引起。光鏡下，DCM心肌纖維常明顯變粗、變性、壞死及纖維化。電鏡下，心肌細胞內(nèi)肌原纖維含量減少，線粒體增大，增多，嵴斷裂或消失，肌漿網(wǎng)擴張，糖原增多。氧化應(yīng)激被認為是參與DCM心肌損傷的重要機制之一。臨床研究發(fā)現(xiàn)DCM患者左心室中過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、Mn-過氧化物歧化酶等活性及基因表達均降低，從而清除氧化自由基能力降低[8]。抗氧化藥物依達拉奉能通過抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）亞基表達，抑制氧化應(yīng)激及自身免疫誘導(dǎo)的心肌凋亡和纖維化，從而緩解DCM進展[9]。

SIRT1是一種新的長壽基因，靶基因包括腫瘤抑制蛋白p53、RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄因子TAF168、DNA終末結(jié)合蛋白Ku70[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因敲除的小鼠胚胎心臟發(fā)育停滯[13]。在抗肌萎縮蛋白敲除小鼠模型中，SIRT1激動劑白藜蘆醇能改善心肌細胞的病理變化，而該作用由其激動SIRT1抑制p300蛋白表達介導(dǎo)[14]。過表達SIRT1能通過FoxO增加抗氧化蛋白過氧化氫酶表達，從而抑制百草枯引起心臟氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。本實驗在DCM大鼠心肌組織中證明，SIRT1的表達顯著低于正常對照組。我們推測，SIRT1的表達下調(diào)參與了DCM的發(fā)生與發(fā)展，然而其具體作用機制還有待進一步研究。

[1] Huang J,Gan Q.SIRT1 overexpression antagonizes cellular senescence with activated ERK/S6k1 signaling in human diploid fibroblasts[J].PLoS One,2008,3(3):e1710.

[2] Kao CL,Chen LK.Resveratrol protects human endothelium from H(2)O(2)-induced oxidative stress and senescence[J].J Atheroscler Thromb, 2010,17(9):970-979.

[3] Sun C,Zhang F.SIRT1 improves insulin sensitivity under insulinresistant conditions by repressing PTP1B[J].Cell metabolism, 2007,6:307-319.

[4] Alcendor RR,Gao S.Sirt1 regulates aging and resistance to oxidative stress in the heart[J].Circ Res,2007,100(10):1512-1521.

[5] Tanno M,Kuno A.Induction of manganese superoxide dismutase by nuclear translocation and activation of SIRT1 promotes cell survival in chronic heart failure[J].J Biol Chen,2010,285(11): 8375-8382.

[6] Sulaiman M,Matta MJ.Resveratrol,an activator of SIRT1, upregulates sarcoplasmic calcium ATPase and improves cardiac function[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,298(3):H833-843.

[7] Planavila A,Iglesias R.Sirt1 acts in association with PPARalpha to protect the heart from hypertrophy metabolic dysregulation, and infiammation [J]. Cardiovasc Res,2011,90(2):276-284.

[8] Baumer AT,Flesch M.Antioxidative enzymes in human hearts with idiopathic dilated cardiomyopathy[J].J Mol Cell Cardiol, 2000,32:121-130.

[9] Arumugam S,Thandavarayan RA.Beneficial effects of edaravone [J].J Cell Mol Med,2012,16:2176-2185.

[10] Luo J,Li M.Acetylation of p53 augments its site-specific DNA binding both in vitro and in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(8):2259-2264.

[11] Muth V,Nadaud S.Acetylation of TAF(I)68,activates RNA polymerase I transcription[J].EMBO J,2001,20:1353-1362.

[12] Jeong J,Juhn K.SIRT1 promotes DNA repair activity and deacetylation of Ku70[J].Exp Mol Med,2007,39(1):8-13.

[13] Sakamoto J,Miura T.Predominant expression of Sir2alpha,an NAD-dependent histone deacetylase[J].FEBS Lett,2004,556(1-3): 281-286.

[14] Kuno A,Hori YS.Resveratrol Improves Cardiomyopathy in Dystrophin-deficient Mice through SIRT1 Protein-mediated Modulation of p300 protein[J].J Biol Chem,2013,288(8):5963-5972.

Involvement of SIRT1 Expression in Heart Dysfunction from Dilated Cardiomyopathy Rat

LIU Du1, ZHOU Qian-yi2, LI Xiao-jing3, ZHANG Shu-juan1, ZHU Lei1, ZHAO Yun-hai1, YUAN Xin-chu2, YUAN Qiong1

(1 Department of Pharmacology, College of Pharmacy ,Wuhan University Science and Technology, Wuhan 430081, China; 2 Department of Histology and Embryology, Wuhan University Science and Technology, Wuhan 430081, China; 3 Department of Ultrasonic Imaging , Tianyou Hospital, Wuhan University Science and Technology, Wuhan 430000, China)

Objective To demenstrate the relationship of SIRT1 expression and heart dysfunction from dilated cardiomyopathy (DCM) rat.Methods The rat model of DCM was established by intraperitoneal injection of adriamycin once a week for 8 weeks. Left ventricular end diastolic diameter,1eft ventricular end systolic diameter and left ventricular ejection fraction were measured by Doppler. The expression of SIRT1 was detected with immunohistochemistry and Western Blotting,respectively.Results Compared with the normal rats,both the LVDD and LVDS were increased and the LVEF decreased.The expression of SIRT1 was down-regulated significantly in the rats with DCM.Conclusion The expression of SIRT1 downregulation in the cardiomyocytes may be associated with the progression and pathogenesis of DCM.

Dilated cardiomyopathy; SIRT1

R542.2

B

1671-8194（2013）25-0053-02

*通訊作者