抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素對(duì)肥胖大鼠胰島β細(xì)胞功能的影響

樸松蘭 周禹含

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130017）

抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素對(duì)肥胖大鼠胰島β細(xì)胞功能的影響

樸松蘭 周禹含

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130017）

抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素；胰島β細(xì)胞；肥胖；影響

近年來(lái)我國(guó)肥胖發(fā)病率不斷攀升，已引起社會(huì)各界的關(guān)注。肥胖經(jīng)成為2型糖尿病、高血壓、代謝綜合征等疾病的主要危險(xiǎn)因素，尤與2型糖尿病關(guān)系密切，可能與胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞損傷有關(guān)。已有報(bào)道肥胖患者氧化應(yīng)激明顯，由此產(chǎn)生的氧自由基也明顯增加。本研究選用硒（Se）、釩（V）、鉻（Cr）和維生素E等微量營(yíng)養(yǎng)素，觀察其對(duì)肥胖大鼠胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能的影響，以探討使用抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素（antioxidant micronutrients， AM）干預(yù)肥胖致2型糖尿病的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠35只，體質(zhì)量150～170g，購(gòu)于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

高脂飼料由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制：每100g高脂飼料含有基礎(chǔ)飼料 60g，豬油15g，蛋黃粉13g，干酪素10g，白糖2g?；A(chǔ)飼料總熱能3.29kcal/g（碳水化合64.44%、蛋白質(zhì)21.88%、脂肪13.68%）；高脂飼料總熱能4.62kcal/g（碳水化合物30.15%、蛋白質(zhì)22.00%、脂肪49.85%）。

1.3 血糖儀

北京怡成JPS-7血糖儀檢測(cè)。

1.4 免疫組化試劑盒及抗體

武漢博士德公司。

1.5 抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素

硒酸脂多糖為上海天賜福生物公司產(chǎn)品，醋酸維生素E 由浙江新昌制藥有限公司提供，釩酸鈉為上海試劑三廠產(chǎn)品，富鉻酵母由北京中科院高能物理研究所提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備及分組

購(gòu)入大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組（10只），喂以基礎(chǔ)飼料，高脂飼料組（25只），喂養(yǎng)豬油為主要脂肪成分配制的高脂飼料。第8周末，高脂實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量基本穩(wěn)定，參照正常對(duì)照組大鼠的平均體質(zhì)量及標(biāo)準(zhǔn)差，篩選肥胖模型（體質(zhì)量大于對(duì)照組平均體質(zhì)量加1.96倍標(biāo)準(zhǔn)差），未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)者剔除。將肥胖模型大鼠分為干預(yù)組（9只）和模型對(duì)照組（9只）。

2.2 微量營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑量及方法

每日以按千克體質(zhì)量140μgSe（16.60mg硒酸酯多糖）、1.785mgV（14mgNaVO4·12H2O）、140μgCr（127.27mg富鉻酵母）灌胃，飼含VE的軟料（相當(dāng)于100mgVE/千克體質(zhì)量、每日）。

2.3 胰腺Insulin免疫組化、定量分析

干預(yù)6周后處理大鼠，取胰腺組織，經(jīng)新鮮配置并預(yù)冷（4℃）的4%多聚甲醛固定，應(yīng)用自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行梯度酒精脫水，二甲苯透明，經(jīng)自動(dòng)包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋，使用石蠟切片機(jī)切片，切片厚度為4μm，免疫組化染色，染色步驟如下：①切片常規(guī)脫蠟至水；②3%H2O2室溫5～10min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；蒸餾水洗3次；③滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，；④滴加適當(dāng)稀釋（1∶200）的一抗（兔抗鼠Insulin抗體），4℃過(guò)夜；0.1MPBS洗滌2min×3次；⑤滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃20min；0.1MPBS洗滌2min×3次；⑥滴加試劑SABC，37℃20min；0.1MPBS洗滌5min×4次；⑦DAB室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5～30min之間；蒸餾水洗滌；⑧蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。

每組取5只小鼠胰腺切片供定量分析，每張切片取5個(gè)視野。檢測(cè)平均灰度值。平均灰度：圖像中黑白深淺的程度為圖像的灰度，系統(tǒng)數(shù)字化圖像的精度為256級(jí)。即圖像中最黑到最白之間有256個(gè)灰度級(jí)，最黑的灰度為0；最白的灰度為256。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 血糖

表1 抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素干預(yù)期間血糖變化（mmol/L，）

表1 抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素干預(yù)期間血糖變化（mmol/L，）

*與正常對(duì)照組相比，P＜0.01；**與正常對(duì)照組相比，P＜0.05；①與模型對(duì)照組相比，P＜0.01；②與模型對(duì)照組相比，P＜0.05

分組0周1周2周3周4周5周6周正常對(duì)照組4.15±0.263.83±0.254.26±0.334.09±0.294.17±0.274.31±0.254.21±0.24模型對(duì)照組5.45±0.31*5.46±0.295.33±0.31**5.24±0.275.19±0.335.27±0.285.22±0.23 AM干預(yù)組5.51±0.33①5.45±0.245.31±0.34②5.21±0.365.12±0.484.95±0.334.78±0.37

0周模型對(duì)照組和AM干預(yù)組血糖略高于正常對(duì)照組，但各實(shí)驗(yàn)組間均沒(méi)有顯著差異。1～6周AM干預(yù)組血糖緩慢下降。第6周末，模型對(duì)照組血糖高于正常對(duì)照組，但不明顯；AM干預(yù)組血糖低于模型對(duì)照組，但不明顯。見(jiàn)表1。

3.2 Insulin免疫組化、定量分析

使用免疫組化染色方法檢測(cè)大鼠胰島細(xì)胞Insulin表達(dá)水平，Insulin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色。正常對(duì)照組胰島Insulin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占胰島內(nèi)分泌細(xì)胞的絕大多數(shù)，著色較深，見(jiàn)圖1。肥胖模型對(duì)照組胰島Insulin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞略少于正常對(duì)照組，著色較淺，見(jiàn)圖2。抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素干預(yù)組Insulin陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞多于模型對(duì)照組，著色更深，見(jiàn)圖3。

定量分析結(jié)果表明，肥胖模型對(duì)照組平均灰度值明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素干預(yù)組平均灰度值明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

圖1 ，Insulin免疫組化

圖2 ，Insulin免疫組化圖

3，Insulin免疫組化

表2 實(shí)驗(yàn)各組平均灰度值檢測(cè)結(jié)果（）

表2 實(shí)驗(yàn)各組平均灰度值檢測(cè)結(jié)果（）

*與正常對(duì)照組相比，P＜0.01；②與模型對(duì)照組相比，P＜0.05

分組平均灰度值正常對(duì)照組103.14±5.62模型對(duì)照組136.26±7.33*干預(yù)組124.42±6.89②

4 討 論

肥胖患者中存在氧化應(yīng)激[1]，氧化應(yīng)激與胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞損傷密切相關(guān)。硒是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的組成成分，與其活性密切相關(guān)。而GSH-Px有細(xì)胞抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能完整的酶性保護(hù)系統(tǒng)的主要成分之一。維生素E具有抗氧化作用，而硒加強(qiáng)維生素E的抗氧化作用，清除自由基的損害，協(xié)同保護(hù)細(xì)胞膜及各類生物膜的結(jié)構(gòu)和功能[2]。釩可增加胰島素敏感組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT4）的mRNA水平，增加GLUT1和GLUT4從細(xì)胞內(nèi)到胞膜的轉(zhuǎn)位；Cr3+是葡萄糖耐量因子的組成成分，可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，促進(jìn)葡萄糖的氧化磷酸化，促進(jìn)糖原合成，提高胰島素的穩(wěn)定性，從而降低血糖。

本項(xiàng)目選用硒、釩、鉻和維生素E抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素組合干預(yù)肥胖模型大鼠，觀察其對(duì)胰島素分泌功能的影響。研究結(jié)果顯示，補(bǔ)充抗氧化微量營(yíng)養(yǎng)素能夠保護(hù)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠胰腺細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，明顯改善胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能，提示給肥胖病患者補(bǔ)充AM有可能會(huì)延緩或防止2型糖尿病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)0周模型對(duì)照組血糖升高不明顯，第6周末AM干預(yù)組血糖改善不明顯，可能與造模和干預(yù)時(shí)間短等多方面因素有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究、探討。

[1] Ozata M,Mergen M,Okenli C,et al.Increased oxidative stress and hypozincemia in male obesity[J].Clin Biochen,2002,35(8):627-631.

[2] Agardh CD,Agardh E,Hutberg,et al.Long-standing hyperglycemia in C57BL/6J mice does net affect retinal glutathione levelor endothelial/perieyte radio in retinalpapillaries[J].J Diabetes Compli cations,2000,14(3):146-153.

R587.1

B

1671-8194（2013）22-0080-02

吉林省教育廳“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目吉教科合字[2010]329號(hào)