大鼠腦缺血損傷后MDA含量和SOD活性變化及胡黃連苷Ⅱ干預(yù)作用

鐘 亮張 睿紀(jì)曉軍吳藝玲徐 琦黃 惠

（1 青島市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266041；2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院ICU，山東 青島 266003）

大鼠腦缺血損傷后MDA含量和SOD活性變化及胡黃連苷Ⅱ干預(yù)作用

鐘 亮1張 睿2紀(jì)曉軍2吳藝玲2徐 琦2黃 惠2

（1 青島市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 青島 266041；2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院ICU，山東 青島 266003）

目的 通過正交試驗優(yōu)化胡黃連苷Ⅱ治療大鼠腦缺血損傷的最佳劑量和時間窗。方法 應(yīng)用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法（BCCAO）建立大鼠前腦缺血模型，按照正交試驗設(shè)計分組，經(jīng)腹腔注射胡黃連苷Ⅱ干預(yù)治療，硫代巴比妥酸法測定血清和腦組織中脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）的含量。黃嘌呤氧化酶法檢測血清和腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結(jié)果 胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳效果，根據(jù)血清和腦組織MDA含量分析，均為腦缺血1.5h腹腔注射10mg/kg體質(zhì)量。根據(jù)血清和腦組織SOD活性分析，均為腦缺血1.5h腹腔注射20mg/kg體質(zhì)量。結(jié)論 從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度綜合評價，胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5 h腹腔注射10～20mg/kg體質(zhì)量。

胡黃連苷Ⅱ；腦缺血；劑量；時間窗；MDA；SOD；大鼠

脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）的含量可以反映組織自由基的含量和脂質(zhì)過氧化程度[1-2]。生理情況下，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)將體內(nèi)不斷生成的自由基清除，維持動態(tài)平衡[3]。當(dāng)體內(nèi)氧自由基（OFR）生成增多時，超氧化物歧化酶（SOD）與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)樗?，清除OFR。因此，SOD的活性反映了機體清除OFR的能力[5]。細(xì)胞培養(yǎng)證實，胡黃連苷Ⅱ可減輕H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率[5-7]。動物實驗表明，胡黃連苷Ⅱ能夠抑制大鼠腦缺血再灌注（MCAO/R）后缺血半影區(qū)相關(guān)炎性因子表達和細(xì)胞凋亡，改善大鼠的神經(jīng)行為功能[8-10]。作者前期研究結(jié)果顯示，胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5h腹腔注射20 mg/kg[11]。本實驗旨在檢測血液和腦組織勻漿中MDA水平和SOD活性變化，探討胡黃連苷Ⅱ在腦缺血損傷中的抗氧化作用及最佳治療劑量和時間窗。

1 材料與方法

1.1 動物模型

成年健康雄性SPF級Wistar大鼠30只，體質(zhì)量230～250g，青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供（SCXK（魯）20100010）。動物置實驗室適應(yīng)環(huán)境一周，自由進食、飲水；室溫（23±2）℃，自然光照。隨機取5只為假手術(shù)組，其余動物分離并結(jié)扎雙側(cè)經(jīng)總動脈建立前腦缺血模型[12]。術(shù)前動物禁食12h，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3mL/kg），仰臥固定、無菌操作，術(shù)后2h仍未蘇醒或死亡的4只動物剔除，將成功的21只模型再隨機分為模型組5只和治療組16只。假手術(shù)組不結(jié)扎頸總動脈，其余操作同實驗組。

1.2 設(shè)計分組

將治療組16只動物模型納入統(tǒng)計范圍，按二因素四水平[L16（45）]正交試驗設(shè)計分組（表1）。治療時間窗為A因素，設(shè)缺血1.0h、1.5h、2.0h、2.5h四個水平；治療劑量為B因素，設(shè)5、10、20、40mg/kg體質(zhì)量四個水平。

1.3 干預(yù)措施

胡黃連苷Ⅱ（CAS No：39012-20-9，純度＞98%）由天津奎青醫(yī)藥公司提供，應(yīng)用生理鹽水溶解稀釋成1%溶液，按[L16（45）]正交表設(shè)計，在相應(yīng)的缺血時間腹腔注射相應(yīng)劑量胡黃連苷Ⅱ。假手術(shù)組和模型組術(shù)后2h腹腔注射等量生理鹽水。

表1 [L16（45）]正交試驗設(shè)計分組

1.4 標(biāo)本采集

大鼠給藥24h后，以10%水合氯醛0.3mL/kg腹腔注射麻醉，開胸經(jīng)心臟取血4mL，4000 r/min離心10min，分離血清，-20℃保存。然后經(jīng)心臟灌注生理鹽水200mL，快速開顱，完整取腦，切除嗅球和額葉前部腦組織，自視交叉（Bregma 0.00mm）向后切取缺血部位腦組織500mg，置預(yù)冷研缽中研磨至粉末狀后按1∶4比例加細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所），超聲波勻漿，4℃冷凍離心機（Eppendorf 5801型，德國）12000r/min離心10min，去沉淀組織留上清液，BCA法測定蛋白濃度，-20℃保存。

1.5 檢測指標(biāo)

應(yīng)用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法分別測定血清和腦組織勻漿MDA水平和SOD活性。按試劑盒（南京建成生物科技公司）說明書操作，取血清或腦組織勻漿室溫復(fù)溶，離心取上清100μL，以紫外分光光度計（Beckmann DU640，USA）在波長532nm（MDA）和550nm（SOD）處測定吸光度值，計算MDA（mmol/L）含量和CAT（U/mL）活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。根據(jù)不同水平的缺血（給藥）時間和劑量，及給藥時間和劑量的交互作用對檢測指標(biāo)是否有顯著性影響，得出最佳劑量和時間窗。

2 結(jié) 果

2.1 檢測結(jié)果

造模后動物血清和腦組織MDA含量較假手術(shù)組均顯著升高，而SOD活性均顯著降低。治療后血清和腦組織MDA含量較模型組均顯著減低，而SOD活性均顯著升高。見表2。

表2 MDA和SOD檢測結(jié)果

2.2 MDA含量方差分析

因素A（時間）的不同水平對腦缺血后血清MDA含量的影響有顯著性差異（P＜0.01），而因素B（劑量）和因素C（時間-劑量交互作用）的影響未見顯著性差異（P＞0.05）。說明不同水平的給藥時間（治療時間窗）對血清MDA含量有顯著性影響，而不用水平的給藥劑量對血清MDA含量無顯著性影響。給藥時間與給藥劑量之間也無顯著性交互作用。應(yīng)用最小顯著差數(shù)法（LSD）對各組數(shù)據(jù)進行兩兩比較顯示：血清MDA含量在給藥（缺血）時間1.0h（A1）與2.5h（A4）、1.5h（A2）與2.5h（A4）之間有顯著性差異（P＜0.05），其余給藥時間比較均無顯著差異（P＞0.05）；血清MDA含量在不同水平的給藥劑量之間均無顯著差異（P＞0.05）。根據(jù)給藥劑量最小化和治療時間窗最大化原則分析，以A2B2組合最好，即胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳治療時間窗和給藥劑量為腦缺血1.5h腹腔注射10 mg/kg體質(zhì)量。

不同水平的給藥時間或治療時間窗（因素A）對腦組織中MDA的含量有顯著性影響（P＜0.01），而不用水平的給藥劑量（因素B）對MDA含量無顯著性影響（P＞0.05），給藥時間與給藥劑量（因素C）之間也無顯著性交互作用（P＞0.05）。LSD兩兩比較顯示：腦組織中MDA含量在給藥（缺血）時間1.0h（A1）與2.5h（A4）、1.5h（A2）與2.5h（A4）之間有顯著性差異（P＜0.05），其余給藥時間水平之間均無顯著性差異（P＞0.05）；在不同水平的給藥劑量之間均無顯著差異（P＞0.05）。根據(jù)給藥劑量最小化和治療時間窗最大化原則分析，以A2B2組合最好，即胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳治療時間窗和給藥劑量為腦缺血1.5h腹腔注射10 mg/kg體質(zhì)量。見表3。

表3 MDA含量方差分析

2.3 SOD活性方差分析

因素A（時間）和因素B（劑量）的不同水平對腦缺血后血清SOD活性的影響均有顯著性差異（P＜0.01），而因素C（時間-劑量交互作用）的影響未見顯著性差異（P＞0.05）。說明不同水平的缺血時間即治療時間窗和給藥劑量對血清SOD活性均有顯著性影響，而給藥時間與給藥劑量的交互作用對血清SOD活性無顯著性影響（P＞0.05）。LSD兩兩比較顯示：血清SOD的活性在給藥（缺血）時間1.5h（A2）與2.5h（A4）、2h（A3）與2.5h（A4）之間有顯著性差異（P＜0.05），其余給藥時間比較均無顯著性差異（P＞0.05）；在給藥劑量5mg（B1）與20mg（B2）、20mg（B3）與40mg（B4）之間有顯著性差異（P＜0.05），其余給藥時間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。根據(jù)治療時間窗最大化和用藥劑量最小化原則，以A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和治療劑量為腦缺血1.5h腹腔注射20 mg/kg體質(zhì)量。

缺血時間即治療時間窗（因素A）對腦缺血后腦組織中SOD的活性有顯著性影響（P＜0.05），而給藥劑量（因素B）和時間-劑量交互作用（因素C）對SOD活性的影響無顯著性差異（P＞0.05）。LSD兩兩比較顯示：腦組織中SOD的活性在給藥（缺血）時間1.0h（A1）與1.5h（A2）、1.5h（A2）與2.0h（A3）1.5h（A2）與2.5h（A4）、2.0h（A3）與2.5h（A4）之間無顯著性差異（P＞0.05），其余給藥時間比較均有顯著性差異（P＜0.05）；在給藥劑量10mg（B1）與40mg（B2）、20mg（B3）和40mg（B4）之間有顯著性差異（P＜0.05），其余給藥時間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。從治療時間窗最大化和用藥劑量最小化的角度考慮，以A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和治療劑量為腦缺血1.5h腹腔注射20 mg/kg體質(zhì)量。見表5。

表4 SOD活性方差分析

3 討 論

動物實驗表明，胡黃連苷Ⅱ能改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)行為功能，這一作用與胡黃連苷Ⅱ提高大鼠腦組織的抗氧化能力、減少腦缺血再灌注所致的氧化性損傷有關(guān)[13-15]。細(xì)胞培養(yǎng)證實[5-7]，胡黃連苷通過提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性抑制自由基產(chǎn)生，發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化損傷作用。顧偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷Ⅱ?qū)ρ趸瘧?yīng)激損傷L-02細(xì)胞具有保護作用，其機制可能與降低細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧（ROS）的含量，進而抑制細(xì)胞線粒體膜電位的降低有關(guān)。本實驗檢測指標(biāo)中，MDA可以直接反應(yīng)出腦缺血損傷時體內(nèi)自由基含量的變化，SOD則可以體現(xiàn)腦缺血損傷時體內(nèi)抗氧化酶活性的變化。按[L16（45）]正交試驗設(shè)計分組，大鼠腦缺血1h、1.5h、2h和2.5h四個時間點，分別給予胡黃連苷Ⅱ5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg四個劑量，通過檢測MDA和SOD指標(biāo)結(jié)果表明，給藥時間和用藥劑量對于胡黃連苷Ⅱ的治療效果有顯著性差異，不同檢測指標(biāo)最佳組合結(jié)果不盡一致，從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A2B2和A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5 h腹腔注射10～20mg/kg體質(zhì)量。本研究僅觀察了以上指標(biāo)的變化，難免有所偏差。因此，胡黃連苷Ⅱ的確切作用機制和最佳治療時間窗和給藥劑量尚有待于結(jié)合其他檢測指標(biāo)綜合評價。

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The Effect of PicrosideⅡ on the Concentration of NO and the Activity of GSHPx after Cerebral Ischemic Injury in Rats

ZHONG Liang1, ZHANG Rui2, JI Xiao-jun2, WU Yi-ling2, XU Qi2, HUANG Hui2
(1 Department of Neurology, the Third People’ Hospital of Qingdao, Qingdao 266041, China; 2 The Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University, Qingdao 266003, China)

Objective To optimize the therapeutic dose and time window of picrosede Ⅱin cerebral ischemic injury in rats by orthogonal test.Methods The forebrain ischemia models were established by bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) methods.The successful models were randomly grouped according to orthogonal experimental design and treated by injecting picroside Ⅱ intraperitonenally at different ischemic time with different dose.The concentration of lipid perioxide malondialdehyde (MDA) in serum and tissue of was determined by thiobarbituric acid assay.The activity of superoxide dismutase (SOD) in serum and brain tissue was determined by xanthine oxidase assay.Result The optimized composition of the therapeutic dose and time window of picroside Ⅱ in cerebral ischemic injury was ischemia 1.5h with 10mg/kg body weight according to the concentration of MDA in serum and brain tissue, ischemia 1.5h with 20mg/kg body weight according to the activity of SOD in serum and brain tissue. Conclusion From the principle of lowest therapeutic dose with longest tome window, the optimized composition of the therapeutic dose and time window of picroside Ⅱ in cerebral ischemic injury is ischemia 1.5h with 10-20mg/kg body weight.

Picroside Ⅱ; Cerebral ischemia; Therapeutic dose; Time window; SOD; MDA; Rats

R364

B

1671-8194（2013）22-0005-03

山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2011HM050）