長(zhǎng)期保存綿羊凍精的解凍活力與受胎效果觀察

楊菊清 ，楊風(fēng)云 ，張?jiān)鰪?qiáng) ，周新華 ，竇來義 ，周光瑞 ，謝鵬貴，別爾克博爾·博洛提漢

（1.伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆伊寧 835000；2.新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)四師七十九團(tuán)畜牧中心；4.新疆美利奴細(xì)毛羊科技發(fā)展有限責(zé)任公司；5.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站）

我國(guó)成功制作的第一批澳洲美利奴種公羊顆粒凍精迄今為止已保存了30多年，為了檢驗(yàn)其保存效果，作者等根據(jù)不同時(shí)期細(xì)毛羊育種需要，曾陸續(xù)在不同細(xì)毛羊育種場(chǎng)共進(jìn)行過8次輸精試驗(yàn)，各次試驗(yàn)匯總平均受胎率37.69%，平均產(chǎn)羔率114.33%。在試驗(yàn)過程中，對(duì)這批顆粒凍精在不同試驗(yàn)?zāi)晗藿鈨龊蟛煌盍旱氖芴ヅc產(chǎn)羔情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)精液凍制背景

1972年1月，我國(guó)從澳大利亞進(jìn)口了29只純種澳洲美利奴（中毛型）種公羊，其中分配給新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)6只。這些公羊使用方向：一是為新疆毛肉兼用細(xì)毛羊?qū)а?，以提高其羊毛產(chǎn)量和凈毛率，改善體型外貌、羊毛品質(zhì)；二是與新疆毛肉兼用細(xì)毛羊、新波及波爾華斯母羊級(jí)進(jìn)雜交以培育中國(guó)美利奴羊。為了進(jìn)一步充分利用澳洲美利奴種公羊的優(yōu)良基因，最大限度地挖掘其改良潛力和遺傳資源，由新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)、新疆畜牧研究所（現(xiàn)為新疆維吾爾自治區(qū)畜科院畜牧所）和新疆畜禽改良總站（現(xiàn)為新疆畜牧總站）有關(guān)科技人員組成新疆凍精研制協(xié)作小組，在1975年12月—1976年1月期間，共同凍制了用于長(zhǎng)期保存試驗(yàn)的第一批顆粒凍精。凍制凍精時(shí)，6只種公羊的平均年齡6.5歲，平均體重89.7 kg。由于配種任務(wù)十分繁重，故凍制凍精的時(shí)間選在了非配種季節(jié)［1-2］。

1.2 精液的凍制與保存

在精液采集與凍制期間，澳洲美利奴種公羊采取全舍飼方式飼養(yǎng)管理，由專人管護(hù)。每天投喂苜蓿干草3 kg，混合精飼料（含燕麥、麩皮、油渣、豌豆）1 kg，胡蘿卜1kg，雞蛋1枚，早、晚各驅(qū)趕運(yùn)動(dòng)2 000 m，每天采精2次。采精室溫度為17.8℃，制凍室溫保持在22.2℃。采集的原精液量平均1.0 mL（0.9～1.1），活力0.9～1.0，精子密度30億/mL（20～34億）。精液按1∶1比例進(jìn)行稀釋。稀釋液的主要成分包括乳糖溶液、新鮮卵黃、甘油，加青、鏈霉素若干。經(jīng)稀釋后的精液，先在0～5℃下平衡4 h，在干冰下制成顆粒，劑量0.1 mL/顆，每劑凍精顆粒中的有效精子數(shù)不低于4 500萬個(gè)，凍制后浸于液氮中保存。凍精制成后，存放在新疆畜禽改良總站，用于長(zhǎng)期保存。

1.3 試驗(yàn)羊群

本批凍精的系列輸精試驗(yàn)先后在新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)、烏魯木齊南山種羊場(chǎng)、溫泉種畜場(chǎng)和新疆美利奴公司尼勒克基地等細(xì)毛羊種畜場(chǎng)或養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行［3-5］。所有參加顆粒凍精輸精試驗(yàn)的生產(chǎn)母羊均由各試驗(yàn)羊場(chǎng)提供。入選的母羊年齡2～7歲（個(gè)別優(yōu)秀者還放寬到8歲）、配種時(shí)體重45 kg以上，身體健康、無生殖道疾病、被毛細(xì)度64～66支（20.1～23.0 μm）。所有參加凍精輸精的母羊均系自然發(fā)情，每天凌晨采用試情公羊試出。

1.4 凍精解凍與輸精

1.4.1 凍精解凍 在進(jìn)行本系列試驗(yàn)期間，顆粒凍精采用了干解凍法和濕解凍法2種方法進(jìn)行解凍［4］。干解凍法（1978—1995年）：在消毒好的試管里放入2個(gè)凍精顆粒，在80℃溫水里快速解凍；濕解凍法（2008年）：先在小試管中加檸檬酸鈉液0.5～1.0 mL，旋轉(zhuǎn)一圈后倒出，將管壁上剩余的少許液體加熱至40℃，投入2個(gè)凍精顆粒后，在40℃溫水中水浴。2種解凍方法都要求待顆粒溶解到1/3時(shí)取出試管，手搓至完全解凍。解凍后立即進(jìn)行鏡檢，活力評(píng)分采用“0～1等級(jí)”的十級(jí)分制加以評(píng)定。

1.4.2 輸精 凍精輸精在系列試驗(yàn)的8次輸精過程中，分別采用了常規(guī)子宮頸口深部輸精法（5次）和腹腔鏡子宮角輸精法（3次），每種方法輸精量均0.2 mL，含有效精子數(shù)在0.6億個(gè)以上。常規(guī)方法（1975年、1977年、1980年、1986年）：采取子宮頸深部輸精，每次輸解凍凍精2顆（0.2 mL），上午和下午各輸精1次；參加2008年試驗(yàn)的羊只僅在上午輸精1次，下午不再輸精，僅少數(shù)發(fā)情持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的母羊，如果第2天仍然被試情公羊試出，就用原配種公羊凍精再輸精1次。腹腔鏡子宮角輸精（1987年、1991年、1995年）法：將試驗(yàn)羊固定于保定架上，抬高后軀，術(shù)部經(jīng)消毒后用氣腹針充氣。使用套管針在母羊腹部靠近乳房約3 cm處扎孔，分別插入內(nèi)窺鏡和撥棒。開啟電源后，在撥棒的幫助下找到子宮角。然后在子宮角靠近輸卵管的1/3處扎入輸精器，將精液緩慢輸入，每側(cè)子宮角輸凍精1顆（0.1 mL），共輸精0.2 mL。輸精后緩慢抽出輸精器及內(nèi)窺鏡、套管、撥棒。最后消毒傷口，將試驗(yàn)羊只放下手術(shù)架，即完成整個(gè)凍精輸精過程。

1.4.3 記錄 輸精的同時(shí)做好相關(guān)記錄，登記項(xiàng)目包括：輸精時(shí)間、公母羊號(hào)、精液活力、輸精量、輸精次數(shù)、復(fù)發(fā)情與復(fù)配情況及輸精時(shí)的氣溫狀況描述。由于第一批澳洲美利奴種公羊的凍精來之不易，為了不浪費(fèi)寶貴的精液，解凍活力評(píng)分0.1的凍精也進(jìn)行了輸精并做了特別注明。

2 結(jié)果與分析

2.1 解凍活力

統(tǒng)計(jì)的凍精解凍后的活力情況詳見表1。在本系列試驗(yàn)中，累計(jì)使用澳洲美利奴種公羊顆粒凍精2 600粒，統(tǒng)計(jì)的有效解凍凍精共1 291劑計(jì)2 582粒，精液解凍后在恒溫環(huán)境下鏡檢。按常例綿羊精液經(jīng)過凍制后，其解凍后的活力通常不及原精液未凍制前的一半水平。本批凍精保存后，曾經(jīng)多次進(jìn)行活力抽檢，目測(cè)活力一直保持在0.3～0.4之間，遠(yuǎn)低于鮮精時(shí)0.9～1.0的活力評(píng)分水平。在統(tǒng)計(jì)鏡檢的1 291劑解凍凍精中，活力評(píng)分在0.4分以上者極少，如評(píng)分0.5者僅5劑占0.39%、評(píng)分0.4者也僅44劑占3.41%，而活力評(píng)分為0.2～0.3者1 080劑占到總劑數(shù)的83.65%；試驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)鏡檢與實(shí)驗(yàn)室抽測(cè)目測(cè)的結(jié)果之間有些差異，這可能是由于試驗(yàn)時(shí)間跨度長(zhǎng)、參加人員多，對(duì)解凍活力的評(píng)估可能存在一定的主觀偏差所致。各次試驗(yàn)解凍后精液的活力在0.3以上者（含0.3者）平均占到解凍凍精總劑數(shù)的53.14%，其中該批凍精在保存32年時(shí)，解凍后精液的活力為0.3者占到60.56%，與保存0年時(shí)的數(shù)據(jù)相比僅有2.1%的降幅。通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析比較，不同保存年限對(duì)精液的解凍活力沒有影響（P ＞0.05），在此前的報(bào)道已有明確闡述［5］。

表1 澳美羊凍精不同保存年份解凍活力

2.2 受胎效果

本批澳洲美利奴種公羊顆粒凍精在8次系列輸精試驗(yàn)中，合計(jì)輸精963只生產(chǎn)母羊，其中363只母羊產(chǎn)羔，共生產(chǎn)羔羊415只，受胎率分別為20.78%、32.0%、50.0%、42.31%、46.58%、41.46%、32.29%和32.39%，平均受胎率37.69%、平均產(chǎn)羔率114.33%［4］。其中保存到第32年時(shí)的受胎率雖然為32.39%，但經(jīng)過生物統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與早期的常規(guī)輸精試驗(yàn)結(jié)果比較，差異均不顯著（P＞0.05）［5］，以此說明這批凍精雖經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)30多年的保存，未顯著影響到其受胎效果。但是試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，凍精解凍后的活力評(píng)分對(duì)受胎率及產(chǎn)羔率的影響都較大，詳見表2。

從試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可見，凍精解凍后的活力越好，輸精后母羊的受胎率和產(chǎn)羔率就越高。不同解凍活力的凍精輸精后受胎率之間差異極顯著（P＜0.01），其相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)羔率也差異顯著（P＜0.05），隨著解凍活力的提高受胎率和產(chǎn)羔率都表現(xiàn)出迅速提高的趨勢(shì)，解凍活力評(píng)分每提高0.1分，平均受胎率提高9.32個(gè)百分點(diǎn)，平均產(chǎn)羔率提高8.33個(gè)百分點(diǎn)。在試驗(yàn)中觀察到有5劑凍精得到了0.5的最高活力評(píng)分，輸精后有3只羊成功受孕，并產(chǎn)羔4只，受胎率和產(chǎn)羔率分別為60.00%和133.33%。而解凍活力在0.3者637劑輸精480只生產(chǎn)母羊，生產(chǎn)羔羊246只，受胎率44.79%，產(chǎn)羔率114.41%，受胎率與產(chǎn)羔率均都顯著低于前者（P＜0.05）。按照凍精輸精規(guī)程的相關(guān)規(guī)定要求，低活力凍精（0.2及以下）不能用于輸精用，但是為了不浪費(fèi)精液，這些活力低下的精液也進(jìn)行了輸精，并取得了意想不到的收獲：162劑活力評(píng)分為0.1的凍精輸精101只母羊后，獲得了23只羔羊，受胎率達(dá)22.77%。這些羊只雖然受孕產(chǎn)羔，生產(chǎn)的羔羊絕大多數(shù)均為單羔（95.65%），僅有1例雙羔（4.35%）。低活力凍精輸精取得的受胎率（22.77%），筆者認(rèn)為有可能是在主觀評(píng)分時(shí)發(fā)生判斷誤差所致。

表2 不同解凍活力澳美羊凍精輸精及產(chǎn)羔情況

采取的輸精方法不同得到的受胎效果也不同（見表3）。比較分析證實(shí)，采用腹腔鏡綿羊?qū)m內(nèi)輸精的效果都要高于常規(guī)宮頸輸精方法，兩者之間差異極顯著（P＜0.01），5次常規(guī)輸精的平均受胎率31.49%，雙羔率只有4.05%，總體效果不如腹腔鏡綿羊?qū)m內(nèi)輸精，而且產(chǎn)羔率也較后者低17.35個(gè)百分點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在同樣活力水平下，腹腔鏡輸精的受胎率高于常規(guī)輸精，其中在0.1、0.2、0.3活力水平時(shí)，兩種方法的受胎率分別相差12.18個(gè)百分點(diǎn)、14.34個(gè)百分點(diǎn)和29.42個(gè)百分點(diǎn)，說明活力好的凍精采取腹腔鏡輸精效果會(huì)更好。但采取腹腔鏡輸精法的母羊平均產(chǎn)羔率為111.89%，低于采用常規(guī)輸精法4.29%，由此可以證明產(chǎn)羔率與母羊的發(fā)情排卵狀況之間的關(guān)系密切，與配種輸精方式之間沒有必然的聯(lián)系。

表3 不同解凍活力凍精輸精方式及產(chǎn)羔情況

3 討論

本批試驗(yàn)的顆粒凍精是我國(guó)最早制作的美利奴型種公羊凍精之一，當(dāng)時(shí)我國(guó)綿羊精液冷凍保存技術(shù)剛剛起步，稀釋液的篩選、平衡、冷凍、解凍的適宜溫度等整個(gè)工藝操作技術(shù)才開始探索。因此，本試驗(yàn)使用的顆粒精液制作時(shí)技術(shù)尚未完全成熟。隨著生物冷凍技術(shù)的不斷提高和改進(jìn)，顆粒型凍精由于精子復(fù)蘇率和受胎率較安瓶型與細(xì)管型凍精要低，且有易受污染、不便標(biāo)記等缺陷，已逐步被適合于機(jī)械化生產(chǎn)又能克服上述缺陷的細(xì)管型凍精所取代。盡管如此，本系列試驗(yàn)經(jīng)過不同的保存時(shí)間、不同試驗(yàn)地點(diǎn)和不同試驗(yàn)條件下的輸精效果觀察，確證了本批顆粒型凍精的凍制質(zhì)量。

通過對(duì)不同試驗(yàn)?zāi)晗藿鈨龊蟮牟煌盍菏芴デ闆r的統(tǒng)計(jì)分析，也說明長(zhǎng)期冷凍保存的綿羊精液，只要保存得當(dāng)，其解凍活力與受胎效果是不會(huì)因?yàn)楸４婺晗薜倪f增而衰減，至少截止目前的保存年限里，沒有發(fā)現(xiàn)衰退趨勢(shì)。同時(shí)，綿羊精液在冷凍制作過程中，對(duì)精子本身產(chǎn)生的傷損作用，采用腹腔鏡輸精子宮角輸精法進(jìn)行輸精，可以縮短精子的游走距離，降低精子的運(yùn)動(dòng)能耗，從而有效地提高受胎率和多胎率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，凍精解凍的活力越好，使用腹腔鏡輸精受孕的幾率越大，因而，在使用長(zhǎng)期保存的綿羊凍精進(jìn)行配種時(shí)，采用腹腔鏡輸精子宮角輸精法效果要更好。

［1］胡連志，楊菊清，郭文惠.腹腔鏡綿羊?qū)m內(nèi)輸精初試［J］.中國(guó)畜牧雜志，1989，25（5）：22.

［2］胡連志，徐佩賢，段長(zhǎng)存.冷凍保存十五年的綿羊精液受胎效果［J］.草食家畜，1993（3）：20.

［3］田可川，阿扎提，史梅英，等.保存20年的美利奴羊凍精腹腔鏡輸精試驗(yàn)［J］.中國(guó)畜牧雜志，1999（1）：33.

［4］楊菊清，張?jiān)鰪?qiáng)，周光瑞，等.綿羊凍精不同保存年限的受胎效果連續(xù)觀察［J］.草食家畜，2009（3）：40-43.

［5］周光瑞，楊菊清.長(zhǎng)期保存的綿羊凍精輸精受胎效果觀察［C］//2010年新疆畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)年會(huì)論文集.新疆畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)部資料，2010：1-3.