合成氣發(fā)酵制取乙醇微生物的對比

宋安東，馮新軍，王風(fēng)芹，謝慧，楊大嬌

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450002

2 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室，河南鄭州 450002

生物質(zhì)是一種豐富的可再生資源，利用生物質(zhì)可以生產(chǎn)燃料乙醇，最主要的方法有兩種，即生物化學(xué)法和熱化學(xué)法，后者又包括化學(xué)合成和微生物發(fā)酵[1]。微生物發(fā)酵合成氣生產(chǎn)乙醇，是以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)乙醇的一種新技術(shù)。即將生物質(zhì)完全氣化，得到以H2、CO、CO2、N2等為主要成分的合成氣，再利用一些特殊的微生物將合成氣發(fā)酵為乙醇。該技術(shù)不需要昂貴的酶、酸、堿等試劑，可以將木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)完全氣化，微生物轉(zhuǎn)化理論上可以完全利用有效氣體，屬環(huán)境友好型技術(shù)[2]。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以利用合成氣合成乙醇的微生物還比較少[3-4]，主要是一些常溫微生物和個別的嗜熱微生物[5]。國外一些科研工作者，陸續(xù)從動物糞便(雞糞[6]、兔糞[7]等)、下水道污泥[6]、農(nóng)業(yè)瀉湖[8]、煤漿[6]等物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了一些能夠利用合成氣生產(chǎn)乙醇的微生物，開展的研究主要集中在梭狀芽胞桿菌Clostridium ljungdahlii和梭狀芽胞桿菌Clostridium carboxidivorans 兩株菌上[9-21]。國內(nèi)缺少具專利權(quán)的相關(guān)菌株，郭穎等[22-23]以國外研究較少的C.autoethanogenum為對象進(jìn)行了一些研究。

實驗室在前期以羊駝、長臂猿、小熊貓、狒狒的糞便為樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)時，得到可利用合成氣發(fā)酵制取乙醇的A-fm 4、G-fm 4、Lp-fm 4、B-fm 4等4種菌群。本研究以4種富集菌群為研究對象，與合成氣發(fā)酵菌株C.autoethanogenum在兩種接種量下發(fā)酵合成氣生產(chǎn)乙醇的能力進(jìn)行了對比。

1 材料與方法

1.1 菌株

A-fm 4、G-fm 4、Lp-fm 4、B-fm 4均為本實驗室富集篩選得到的菌群，C.autoethanogenum DSM10061購自德國菌種保藏中心(DSMZ)。

富集菌群在前期試驗中通過PCR-DGGE 技術(shù)進(jìn)行了初步鑒定，表1是對4種富集菌群中主要微生物的16S rDNA 序列測序后的初步鑒定結(jié)果。

1.2 培養(yǎng)基及配制方法

DSM640活化培養(yǎng)基(g/L)：NH4Cl 0.90，NaCl 0.90，MgCl2·6H2O 0.40，KH2PO40.75，K2HPO41.50，胰蛋白胨2.00，酵母膏1.00，F(xiàn)eCl3·6H2O 2.40×10?3，纖維二糖1.00，L-鹽酸半胱氨酸0.75，木糖5.00。纖維二糖在培養(yǎng)基滅菌后過濾加入，微量元素溶液1 mL，pH 6.0。

改良培養(yǎng)基(g/L)[13]：NaCl 1.20，NH4Cl 1.50，KCl 0.15，MgSO4·6H2O 0.30，CaCl20.06，KH2PO40.30，酵母膏0.50，2-嗎啉乙磺酸5.00，L-鹽酸半胱氨酸0.20，木糖5.00。微量元素溶液添加10 mL，維生素溶液添加10 mL，pH 5.75。pH 的調(diào)節(jié)應(yīng)在加入2-嗎啉乙磺酸后立即進(jìn)行。

表1 富集菌群中優(yōu)勢微生物16S rDNA 片段序列的比對結(jié)果Table 1 Comparison of 16S rDNA sequences of dominant microbes by sequencing and Blast analysis

發(fā)酵培養(yǎng)基[23](g/L)：NH4Cl 1.00，NaCl 1.00，MgSO40.15，KH2PO40.10，CaCl20.04，胰蛋白胨2.00，酵母膏0.30，L-鹽酸半胱氨酸0.20，2-嗎啉乙磺酸10.00。另礦質(zhì)元素溶液10 mL，維生素溶液10 mL，pH 4.5。

維生素貯液[13](mg/L)：VB610，硫胺素5.00，VB25.00，泛酸鈣5.00，硫辛酸5.00，對氨基苯甲酸5.00，煙堿酸5.00，VB125.00，生物素2.00，葉酸2.00。配好后用0.22μm 過濾器過濾除菌使用。

微量元素貯液[13](g/L)：氨三乙酸2.00，MgSO41.00，(NH4)2SO4·FeSO4·6H2O 0.80，CoCl2·6H2O 0.20，ZnSO4·7H2O 0.20，CuCl2·2H2O 0.02，NiCl2·6H2O 0.02，Na2MoO4·2H2O 0.02，Na2O4Se 0.02，Na2WO4·2H2O 0.02。

所有培養(yǎng)基按配方配制，每80 mL (發(fā)酵培養(yǎng)基為60 mL)分裝入300 mL 的厭氧培養(yǎng)瓶中，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，在培養(yǎng)基中加入刃天青，添加量為0.50 mg/L。配好的培養(yǎng)基放置在充滿合成氣的厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)放置24～36 h，緩慢去除溶解氧。然后121℃，1.01×104Pa 滅菌20 min。維生素溶液和鹽酸半胱氨酸采用0.45μm 的濾膜過濾除菌。

1.3 合成氣

合成氣組成為CO 85.5%，H210%，CO24.5%，購自河南源正科技發(fā)展有限公司。

1.4 菌種的活化

C.autoethanogenum 的活化：首次活化，打開安瓿瓶，加入已滅菌的活化培養(yǎng)液0.5 mL，浸潤30 min；用1 mL 注射器吸取200μL，注射入平板培養(yǎng)瓶并涂布，維持在37℃。觀察生長情況，7 d 左右菌種生長良好。向平板培養(yǎng)瓶添加20 mL 活化培養(yǎng)液，培養(yǎng)96 h。再次活化，直接從平板培養(yǎng)瓶中吸取培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接到新鮮的活化培養(yǎng)液中，接種量10%，進(jìn)行培養(yǎng)。

富集菌群的活化：取A- fm 4、G- fm 4、Lp- fm 4和B- fm 4的保存培養(yǎng)液加入活化培養(yǎng)基中，添加量為10%。

1.5 接種菌齡的確定

采用比濁法，將活化后的菌液接入改良培養(yǎng)基中(接種量10%)，每隔一段時間(C.autoethanogenum 為每12 h，富集菌群為每8 h)取一定菌液，在600 nm 下，用可見分光光度計測量OD 值，測定至生物量增長緩慢或不再增長為止，繪制生長曲線，確定生長對數(shù)期。

1.6 不同接種量的影響

10%接種量發(fā)酵：將在改良培養(yǎng)基中生長至接種期的菌液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)液中，接種量為10%，利用注射器，向厭氧瓶內(nèi)充入約200 mL 合成氣。溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的條件下培養(yǎng)3 d。

25%接種量發(fā)酵：將在改良培養(yǎng)基中生長至接種期的菌液完全離心，收集菌體后用改良培養(yǎng)基懸浮至12 mL，接入4瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(即每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基接入3 mL)，利用注射器，向厭氧瓶內(nèi)充入約200 mL 合成氣。溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min 的條件下培養(yǎng)3 d。

1.7 產(chǎn)物的測定

用注射器抽取1.5 mL 發(fā)酵液，于?4℃，8000 r/min 離心10 min，取上清液測量乙醇濃度。測定乙醇含量采用Agilent technologies 7890A GC System 氣相色譜，檢測器采用FID，柱子為30 m×0.32 mm×0.3μm HP-FFAP，載氣為氮氣，載氣流率30 mL/min，分流比1∶30，色譜進(jìn)樣口和檢測器的溫度分別為200℃和250℃。

1.8 主要設(shè)備

YX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，溫度設(shè)置為37℃，每次使用前進(jìn)行氮氣置換5～7次，以保證厭氧環(huán)境。

厭氧培養(yǎng)瓶購自海門市科儀實驗儀器廠。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種菌齡的確定

2.1.1 C.autoethanogenum 接種菌齡

用比濁法繪制生長曲線(圖1)。由圖1可以看出C.autoethanogenum 在36 h 開始進(jìn)入對數(shù)生長期，大約96 h 生長速度明顯減慢，逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。生長較快的時期是60～84 h，72 h 時生長速率達(dá)到最大。選擇72 h 為發(fā)酵接種菌齡。

2.1.2 富集菌群接種菌齡

分析圖2可以看出G- fm 4由8 h 開始進(jìn)入對數(shù)生長期，大約48 h 時菌體生長速度減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期；A- fm 4、Lp- fm 4和B- fm 4適應(yīng)期不明顯，進(jìn)入穩(wěn)定期的時間分別在40 h、56 h、64 h左右。富集菌群生長最快的時期都在32 h 左右，選擇32 h 為最佳發(fā)酵接種菌齡。

圖1 梭狀芽胞桿菌生長曲線Fig.1 Growth curve of C.autoethanogenum.

圖2 富集菌群生長曲線Fig.2 Growth curve of A- fm 4,G- fm 4,Lp- fm 4 and B- fm 4.

對比圖1和圖2可以看出，對照菌株C.autoethanogenum 有24 h 左右的生長適應(yīng)期，隨后再進(jìn)入對數(shù)生長期；而富集菌群的適應(yīng)期不明顯，除G- fm 4外，接種后立即進(jìn)行對數(shù)生長。但是，C.autoethanogenum 在96 h 進(jìn)入穩(wěn)定期時的OD600值達(dá)到1.4左右，而4種富集菌群最大OD600值只有0.5左右。

2.2 發(fā)酵時間的確定

將在改良培養(yǎng)基中生長至72 h 的C.autoethanogenum 以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，每12 h 取一次樣測乙醇產(chǎn)量，得到結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，C.autoethanogenum 的乙醇產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長有所增加，在72 h時達(dá)到最高值，72 h 后乙醇產(chǎn)量總體呈現(xiàn)降低趨勢。所以將72 h 作為發(fā)酵的最佳時間。

2.3 接種量對乙醇產(chǎn)量的影響

2.3.1 10%接種量發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量

由圖4可以看出，在10%接種量情況下，C.autoethanogenum、A-fm 4、G-fm 4、Lp-fm 4和B-fm 4的實驗結(jié)果分別為26.99、349.14、232.16、104.25和79.90 mg/L。富集菌群的乙醇產(chǎn)量普遍高于C.autoethanogenum 的實驗結(jié)果，A-fm 4產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過C.autoethanogenum 報道的最高值259.64 mg/L。

2.3.2 25%接種量發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量

由圖5可以看出，在25%接種量發(fā)酵中，C.autoethanogenum、A-fm 4、G-fm 4、Lp-fm 4和B-fm 4的實驗結(jié)果分別為242.15、485.81、472.73、348.58和272.52 mg/L。富集菌群普遍高于對照菌株C.autoethanogenum，A-fm 4、G-fm 4、LP-fm 4、B-fm 4的乙醇產(chǎn)量分別比C.autoethanogenum 高100.62%、95.20%、44.00%和12.50%，均超過了C.autoethanogenum報道的最高值。

圖3 不同發(fā)酵時間乙醇產(chǎn)量Fig.3 Ethanol production at different time.

圖4 不同菌種乙醇產(chǎn)量比較(10%接種量)Fig.4 Comparison of ethanol production between different strains (10% inoculation size).

圖5 不同菌種乙醇產(chǎn)量比較(25%接種量)Fig.5 Comparison of ethanol production between different strains (25% inoculation size).

比較圖4和圖5可以看出，25%接種量發(fā)酵可以明顯提高乙醇產(chǎn)量，與10%接種量的乙醇產(chǎn)量相比，C.autoethanogenum 和4種富集菌群提高量分別為797.36%、39.14%、103.62%、234.37%和241.08%。

3 結(jié)論與討論

10%接種量發(fā)酵，富集菌群A- fm 4、G- fm 4、LP- fm 4、B- fm 4乙醇產(chǎn)量分別為349.15、232.16、104.25和79.90 mg/L，均高于C.autoethanogenum的26.99 mg/L，A- fm 4的產(chǎn)量高于報道的C.autoethanogenum 最高產(chǎn)量259.64 mg/L。25%接種量發(fā)酵，富集菌群產(chǎn)量分別為485.81、472.73、348.58和272.52 mg/L，普遍高于對照菌株C.autoethanogenum 的242.15 mg/L 及其報道最高值。在相同的生長環(huán)境下，發(fā)酵實驗接種時富集菌群的菌體密度小于C.autoethanogenum，乙醇產(chǎn)量卻高于后者，表明富集菌群利用合成氣產(chǎn)乙醇的能力較高。利用合成氣發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的微生物種類偏少，國內(nèi)針對此類微生物的篩選還未見報道。由以上數(shù)據(jù)可知，4種富集菌群能夠利用合成氣合成乙醇，對國內(nèi)在該領(lǐng)域的研究具有重要意義。

25%接種量發(fā)酵可以明顯提高乙醇產(chǎn)量，與10%接種量的乙醇產(chǎn)量相比，C.autoethanogenum和4種富集菌群提高量分別為797.36%、39.14%、103.62%和234.37%，241.08%。鑒于以上結(jié)果，高接種量發(fā)酵可以作為一種提高乙醇產(chǎn)量的措施。不同菌種發(fā)酵時具有不同的最佳接種量，本文只是對10%接種量和25%接種量兩個梯度進(jìn)行了對比研究，后續(xù)研究應(yīng)設(shè)計多個梯度進(jìn)行對比試驗，確定最佳接種量。

富集菌群的產(chǎn)量明顯高于C.autoethanogenum，且與文獻(xiàn)報道的產(chǎn)量相比具有顯著優(yōu)勢。但是文獻(xiàn)所使用的合成氣組分為CO/CO2(95/5，V/V)，與本試驗使用合成氣氣體成分有一定差別。本實驗中C.autoethanogenum生長曲線與文獻(xiàn)報道的相似，表明本實驗所用合成氣對C.autoethanogenum生長沒有明顯影響，而對乙醇代謝有一定影響。Kan Liu 等以嗜堿菌Alkalibaculum bacchi 為研究對象，利用兩種不同成分的合成氣進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)合成氣的成分不同會影響乙醇產(chǎn)量[24]。

本試驗進(jìn)行發(fā)酵時，發(fā)酵原料來源于罐裝氣體，生物質(zhì)合成氣中除了可利用氣體如CO、CO2、H2等，還含有硫化物、焦油等不可利用甚至有毒物質(zhì)，這些組分會對微生物利用合成氣發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)生影響。郭穎等[25]研究證明生物質(zhì)合成氣中所含的甲苯、苯酚和焦油在一定量情況下可以提高C.autoethanogenum 乙醇的產(chǎn)量。Asma Ahmed等[26]研究證明合成氣中存在NO 時，梭狀芽胞桿菌 Clostridium carboxidivorans P7T的代謝會受到抑制。合成氣的通入方式也會對發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)生影響， Vel Berzin 等[27]以梭狀芽胞桿菌Clostridium sp.MTEtOH550為研究對象采用連續(xù)通氣法，乙醇產(chǎn)量由11.5 g/L 提高到27.2 g/L。后續(xù)試驗需要對這些因素可能造成的影響進(jìn)行研究。

[1]Munasinghe PC,Khanal SK.Biomass-derived syngas fermentation into biofuels:opportunities and challenges.Bioresour Technol,2010,101(13):5013?5022.

[2]Song AD,Feng XJ,Xie H,et al.Comparative analysis on the two technologies of ethanol production from syngas.Chin J Bioprocess Eng,2012,10(5):72?78(in Chinese).宋安東,馮新軍,謝慧,等.合成氣制取乙醇2種技術(shù)比較分析.生物加工過程,2012,10(5):72?78.

[3]Zhang LB,Liu JK,Li D,et al.Study on the Microbiology for syngas ethanol fermentation.Renewable Energy Resour,2007,25(3):27?30(in Chinese).張?zhí)m波,劉繼開,李東,等.合成氣乙醇發(fā)酵的微生物研究.可再生能源,2007,25(3):27?30.

[4]Song AD,Feng XJ,Xie H,et al.Biomass-derived syngas fermentation into fuel ethanol:research progress.Food Ferment Indus,2011,37(6):130?136(in Chinese).宋安東,馮新軍,謝慧,等.生物質(zhì)合成氣發(fā)酵制取燃料乙醇研究進(jìn)展.食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(6):130?136.

[5]Henstra AM,Sipma J,Rinzema A,et al.Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuel production.Curr Opin Biotechnol,2007,18(3):200?206.

[6]Hurst KM,Lewis RS.Carbon monoxide partial pressure effects on the metabolic process of syngas fermentation.Biochem Eng J,2010,48(2):159?165.

[7]Vega JL,Prieto S,Elmore BB,et al.The biological production of ethanol from synthesis gas.Appl Biochem Biotech,1989,20-21(1):781?797.

[8]Liou JS,Balkwill DL,Drake GR,et al.Clostridium carboxidivorans sp.nov.,a solvent-producing clostridium isolated from an agricultural settling lagoon,and reclassification of the acetogen Clostridium scatologenes strain SL1 as Clostridium drakei sp.nov..Int J Syst Evol Microbiol,2005,55(5):2085?2091.

[9]Gaddy JL,Clausen EC.Clostridium ljungdahlii,an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism:US,5173429.1992-12-22.

[10]Najafpour G,Younesi H.Ethanol and acetate synthesis from waste gas using batch culture of Clostridium ljungdahlii.Enzyme Microb Technol,2006,38(1/2):223?228.

[11]Younesi H,Najafpour G,Mohamed AR.Ethanol and acetate production from synthesis gas via fermentation processes using anaerobic bacterium,Clostridium ljungdahlii.Biochem Eng J,2005,27(2):110?119.

[12]Ahmed A,Lewis RS.Fermentation of biomass-generated synthesis gas:effects of nitric oxide.Biotechnol Bioeng,2007,97(5):1080?1086.

[13]Rajagopalan S,Datar RP,Lewis RS.Formation of ethanol from carbon monoxide via a new microbial catalyst.Biom Bioen,2002,23(6):487?493.

[14]Datar RP,Shenkman RM,Cateni BG,et al.Fermentation of biomass-generated producer gas to ethanol.Biotechnol Bioeng,2004,86(5):587?594.

[15]Liou JSC,Balkwill DL,Drake GR,et al.Clostridium carboxidivorans sp.nov.,a solvent-producing clostridium isolated from an agricultural settling lagoon,and reclassification of the acetogen Clostridium scatologenes strain SL1 as Clostridium drakei sp.nov.Int J Syst Evol Microbiol,2005,55:2085-2091.

[16]Lewis RS,Frankman RS,Allyson T,et al.Ethanol via biomass-generated syngas.Int Sugar J,2008,110(1311):150?155.

[17]Ahmed A,Cateni BG,Huhnke RL,et al.Effects of biomass-generated producer gas constituents on cell growth,product distribution and hydrogenase activity of Clostridium carboxidivorans P7T.Biom Bioen,2006,30(7):665?672.

[18]Cotter JL,Chinn MS,Grunden AM.Influence of process parameters on growth of Clostridium ljungdahlii and Clostridium autoethanogenum on synthesis gas.Enzyme Microb Technol,2009,44(5):281?288.

[19]Cotter JL,Chinn MS,Grunden AM.Ethanol and acetate production by Clostridium ljungdahlii and Clostridium autoethanogenum using resting cells.Bioprocess Biosyst Eng,2009,32(3):369?380.

[20]K?pke M,Held C,Hujer S,et al.Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas.Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(29):13087?13092.

[21]Ukpong MN,Atiyeh HK,De Lorme MJ,et al.Physiological response of Clostridiumcarboxidivorans during conversion of synthesis gas to solvents in a gas-fed bioreactor.Biotechnol Bioeng,2012,109(11):2720?2728.

[22]Guo Y,Xu JL,Xu HJ,et al.Medium optimization for the growth of Clostridium autoethanogenum.Renewable Energy Resour,2011,29(1):53?56(in Chinese).郭穎,許敬亮,徐惠娟,等.Clostridium autoethanogenum 的生長培養(yǎng)基優(yōu)化.可再生能源,2011,29(1):53?56.

[23]Guo Y,Xu JL,Zhang Y,et al.Medium optimization for ethanol production with Clostridium autoethanogenum with carbon monoxide as sole carbon source.Bioresour Technol,2010,101(22):8784?8789.

[24]Liu K,Atiyeh HK,Tanner RS,et al.Fermentative production of ethanol from syngas using novel moderately alkaliphilic strains of Alkalibaculum bacchi.Bioresour Technol,2012,104:336?341.

[25]Guo Y,Xu JL,Xu HJ,et al.Study on composition effects of syngas and medium on ethanol production with Clostridium autoethanogenum.Acta Energ Solar Sin,2011,32(9):1370?1374(in Chinese).郭穎,許敬亮,徐惠娟,等.合成氣和培養(yǎng)基組分對C.autoethanogenum 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響研究.太陽能學(xué)報,2011,32(9):1370?1374.

[26]Ahmed A,Lewis RS.Fermentation of biomass-generated synthesis gas:effects of nitric oxide.Biotechnol Bioeng,2007,97(5):1080?1086.

[27]Berzin V,Kiriukhin M,Tyurin M.Elimination of acetate production to improve ethanol yield during continuous synthesis gas fermentation by engineered biocatalyst Clostridium sp.MTEtOH550.Appl Biochem Biotechnol,2012,167(2):338?347.