通氣量和菊粉濃度對(duì)克魯維酵母乙醇發(fā)酵的影響

高教琪，袁文杰，陳麗杰，韓錫銅，白鳳武

大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024

生物燃料，作為目前化石燃料的主要替代物，是未來(lái)能源工業(yè)的重要發(fā)展方向[1]。生物乙醇是目前為止研究最早、技術(shù)最為成熟的生物質(zhì)能源產(chǎn)品。它既可以作為燃料直接使用，也可以與汽油和柴油以一定比例配混使用。生物乙醇因其具有較高的辛烷值，而且無(wú)毒，對(duì)環(huán)境污染程度較小，一直以來(lái)都被公認(rèn)為最有可能替代化石能源的生物質(zhì)能源之一[2]。利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇研究較早，技術(shù)也相對(duì)比較成熟，已經(jīng)在包括中國(guó)在內(nèi)的世界各國(guó)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。然而，中國(guó)人口多、耕地少的基本國(guó)情，嚴(yán)重制約了目前糧食類(lèi)淀粉質(zhì)原料燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，所以，尋找新的非糧作物代替淀粉質(zhì)原料進(jìn)行乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)將是未來(lái)中國(guó)燃料乙醇的主要發(fā)展方向[3]。

我國(guó)已將菊芋作為重點(diǎn)發(fā)展的非糧能源植物列入生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“中華人民共和國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展第十一個(gè)、第十二個(gè)五年規(guī)劃綱要”中。菊芋俗稱(chēng)洋姜或鬼子姜，與其他農(nóng)作物相比具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠、耐寒、耐旱、種植簡(jiǎn)易及產(chǎn)量高等特點(diǎn)[4]，不僅可以為生物能源產(chǎn)品生產(chǎn)開(kāi)辟新的原料來(lái)源，而且有助于生態(tài)環(huán)境保護(hù)。菊芋塊莖中的主要成分是菊粉，是由果糖殘基以β-2,1鍵連接而成的線(xiàn)形多聚物[5]，可以被多種微生物分解產(chǎn)生低聚果糖或果單糖，繼而發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[6-9]。

集成生物加工(Consolidated bioprocessing，CBP)系統(tǒng)集水解酶生產(chǎn)、底物水解和發(fā)酵為一體，在乙醇發(fā)酵的應(yīng)用方面具有非常突出的優(yōu)點(diǎn)，是目前利用許多非糧作物生產(chǎn)燃料乙醇經(jīng)濟(jì)上最具有競(jìng)爭(zhēng)能力的技術(shù)路線(xiàn)[10-11]。馬克斯克魯維酵母可分泌菊粉酶，將菊粉水解為果糖并發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，因此是利用CBP 技術(shù)發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的理想菌株[12]。

目前，利用CBP 技術(shù)發(fā)酵菊粉類(lèi)原料生產(chǎn)乙醇的研究已進(jìn)行多年[6,10-11,13]，主要的研究?jī)?nèi)容是菌株的篩選、發(fā)酵工藝的開(kāi)發(fā)等方面，但發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，乙醇收率低的問(wèn)題仍然存在[14]。

菊粉酶的活性是影響CBP 技術(shù)的關(guān)鍵，而通氣量和底物濃度是影響菊粉酶活性的關(guān)鍵因素[15-17]。目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有文獻(xiàn)對(duì)CBP 技術(shù)中的這兩個(gè)因素進(jìn)行報(bào)道。對(duì)于克魯維乙醇發(fā)酵過(guò)程，也沒(méi)有文獻(xiàn)對(duì)其代謝過(guò)程進(jìn)行報(bào)道。本文研究通氣量和底物濃度交互作用下的菊粉酶活性及乙醇發(fā)酵情況，并通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，增加對(duì)克魯維酵母CBP技術(shù)發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇過(guò)程關(guān)鍵因素的了解，為乙醇發(fā)酵條件下的菊粉酶調(diào)控打下基礎(chǔ)，以提高菊芋發(fā)酵的生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus YX01(ATCC8554，本實(shí)驗(yàn)室馴化后保存)。

1.1.2 主要試劑

菊粉(菊芋的熱水抽提物)購(gòu)于內(nèi)蒙古億利生物技術(shù)有限公司，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定100 g 菊粉水解可得到85 g 還原糖；蛋白胨、酵母浸粉、3,5-二硝基水楊酸、硫酸、NaOH 等均為國(guó)產(chǎn)分析純以上級(jí)產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：4%(W/V)菊粉，2%(W/V)蛋白胨，1%(W/V)酵母粉，pH 自然。121℃滅菌15 min 后使用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：

①50g/L菊粉，2%(W/V)蛋白胨，1%(W/V)酵母粉，pH 自然。121℃滅菌15 min 后使用；135 g/L②或250 g/L 菊粉，2%(W/V)蛋白胨，1%(W/V)酵母粉，pH 自然。115℃滅菌15 min 后使用。

1.2 方法

1.2.1 50g/L菊粉在不同通氣量條件下的發(fā)酵情況

5 L 發(fā)酵罐中裝入2 L 含有50 g/L 菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別按10%的接種量接種培養(yǎng)24 h的種子液，在通氣量分別為0、0.5、1.0 vvm 的條件下，30℃、150 r/min 進(jìn)行批式培養(yǎng)。分別在0、4、8、12、24、36、48、60、72 h 時(shí)取樣，測(cè)定生物量、總糖、還原糖、乙醇和酶活，考察在50 g/L 菊粉、不同通氣量條件下K.marxinaus YX01的發(fā)酵情況。

1.2.2 135g/L 菊粉在不同通氣量條件下的發(fā)酵情況

5 L 發(fā)酵罐中裝入2 L 含有135 g/L 菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同1.2.1。分別在0、12、24、36、48、60、72、96 h 時(shí)取樣，測(cè)定生物量、總糖、還原糖、乙醇和酶活，考察在135 g/L 菊粉、不同通氣量條件下K.marxinaus YX01的發(fā)酵情況。

1.2.3 250g/L 菊粉在不同通氣量條件下的發(fā)酵情況

5 L 發(fā)酵罐中裝入2 L 含有250 g/L 菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同1.2.1。分別在0、6、12、24、36、48、60、72、96、120 h 時(shí)取樣，測(cè)定生物量、總糖、還原糖、乙醇和酶活，考察在250 g/L菊粉、不同通氣量條件下K.marxinaus YX01的發(fā)酵情況。

1.2.4 分析方法

酶活的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]。菊粉酶活性單位定義：一定條件下，以菊粉為底物，每分鐘產(chǎn)生1μmol 果糖所需酶量(U)。

生物量的測(cè)定：采用OD 值法，將菌液適當(dāng)稀釋?zhuān)?20 nm 處測(cè)量其吸光值。

還原糖測(cè)定：取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液，采用DNS 法測(cè)定糖濃度。

乙醇測(cè)定：詳見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。

發(fā)酵液甘油和乙酸的分析方法：將發(fā)酵液在10000× g 下離心5 min，取上清液，采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定。離子交換柱型號(hào)為Aminex HPX-87H。流動(dòng)相為50 mmol/L 的硫酸溶液(HPLC grade)，流速為0.5 mL/min，柱溫為50℃，RI 檢測(cè)器的溫度為50℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菊粉濃度、不同通氣量條件下的乙醇發(fā)酵情況比較

不同菊粉濃度在不同的通氣量下表現(xiàn)出基本相同的規(guī)律。以250 g/L 菊粉濃度為例，由圖1可見(jiàn)，通氣量為1.0 vvm 和0.5 vvm 時(shí)，在發(fā)酵前24 h，總糖濃度快速下降，36 h 左右基本已經(jīng)達(dá)到終點(diǎn)；而不通氣情況下，100 h 左右才到達(dá)終點(diǎn)；還原糖消耗速率方面，通氣量為1.0 vvm和0.5 vvm 時(shí)，在前12 h 左右基本保持穩(wěn)定，或稍有上升，之后迅速下降直至終點(diǎn)時(shí)維持在較低水平；在不通氣時(shí)，前24 h 還原糖濃度會(huì)上升，之后維持一定時(shí)間穩(wěn)定，最后下降至較低水平。通氣條件的乙醇發(fā)酵過(guò)程明顯快于不通氣條件，且0.5 vvm 與1.0 vvm 并未表現(xiàn)出明顯差異，乙醇濃度在發(fā)酵24 h 時(shí)已達(dá)到最高；而不通氣條件下，乙醇濃度持續(xù)升高，到發(fā)酵120 h 達(dá)到最高。

圖1 250g/L初始碳源濃度時(shí)不同通氣條件下K.marxinaus YX01發(fā)酵情況Fig.1 Fermentation of K.marxinaus YX01 under different aeration rates at 250 g/L.(A)1.0 vvm.(B)0.5 vvm.(C)0.0 vvm.

出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于接種后 K.marxinaus YX01分泌的菊粉酶迅速將底物降解成為供其自身利用的果糖等還原糖，通氣情況下，糖的利用速率快，沒(méi)有出現(xiàn)還原糖的積累；但在乙醇濃度方面，不通氣時(shí)達(dá)到84.74 g/L，明顯高于1.0 vvm 和0.5 vvm 時(shí)，是由于在有氧且碳源不足情況下，乙醇作為碳源被重新利用，并且大通氣量導(dǎo)致部分乙醇揮發(fā)。通氣量為1.0 vvm 和0.5 vvm 時(shí)的發(fā)酵情況類(lèi)似，其原因可能是由于在1.0 vvm 時(shí)的生物量略高于0.5 vvm，導(dǎo)致在發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基中的溶氧情況相似，而溶氧并非通氣量是培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵因素。

表1顯示了不同菊粉濃度以及不同通氣量條件下發(fā)酵終點(diǎn)K.marxinaus YX01狀況。不通氣時(shí)乙醇發(fā)酵性能明顯較通氣條件有明顯提高，其中最高的乙醇得率為0.442，達(dá)到了理論值的86.4%；在135 g/L 時(shí)，乙醇發(fā)酵結(jié)果也較為理想，不通氣條件乙醇得率為0.438，達(dá)到理論值的85.7%；在250 g/L，不通氣條件下，乙醇得率為0.433，為理論值的84.7%。但是，隨著初始底物濃度的增加，乙醇發(fā)酵結(jié)果有所下降，而且終點(diǎn)時(shí)殘?zhí)菨舛纫裁黠@增加，這種現(xiàn)象可能由于高濃度底物對(duì)于微生物的生長(zhǎng)有一定影響，而且糖轉(zhuǎn)化形成了較高濃度的乙醇，對(duì)微生物在發(fā)酵后期的生長(zhǎng)產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抑制作用。

2.2 K.marxinaus YX01在不同發(fā)酵條件下菊粉酶的表達(dá)情況

由圖2可以看出，K.marxinaus YX01菊粉酶的表達(dá)受到高濃度碳源的抑制，而且通氣條件下酶活高于不通氣條件下的酶活。在50 g/L 時(shí)，1.0 vvm 條件下，最高酶活力為21.54 U/mL，而不通氣條件下只有9.34 U/mL；但是，當(dāng)糖濃度達(dá)到250 g/L 時(shí)，酶活力受通氣量的影響作用不再顯著，在所有情況下，菊粉酶活力都處于相對(duì)較低水平，是由于較高的糖濃度對(duì)于菊粉酶產(chǎn)生了嚴(yán)重的抑制作用。綜合圖1的結(jié)果，可以看到菊粉酶的活力與乙醇的發(fā)酵速度呈正相關(guān)，說(shuō)明CBP 技術(shù)中糖的水解速率是工藝的關(guān)鍵控制點(diǎn)。

表1 K.marxinaus YX01在不同菊粉濃度、通氣量條件下的發(fā)酵情況Table 1 Comparison of the fermentation by K.marxinaus YX01 under conditions of different inulin concentrations and aeration rates

圖2 發(fā)酵96 h 時(shí)菊粉酶在不同發(fā)酵條件下的表達(dá)活性Fig.2 Inulinase activity under different conditions at 96 h.

2.3 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵液中副產(chǎn)物的分析

在乙醇發(fā)酵過(guò)程中，甘油和乙酸等副產(chǎn)物會(huì)伴隨乙醇的產(chǎn)生而產(chǎn)生，這對(duì)于乙醇的發(fā)酵來(lái)說(shuō)是不利的，它導(dǎo)致了發(fā)酵效率的降低。

圖3 不同初始碳源濃度和不同通氣量條件下甘油和乙酸濃度隨時(shí)間的變化Fig.3 Concentration changes of glycerol and acetic acid under conditions of different inulin concentrations and aeration rates.(A)50 g/L.(B)135 g/L.(C)250 g/L.

由圖3可以看出，不同的發(fā)酵條件對(duì)于甘油的含量具有較大影響。甘油的產(chǎn)生伴隨著乙醇發(fā)酵過(guò)程，且表現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)。隨著初始碳源濃度的增加，甘油的合成量明顯增加，這主要是由于細(xì)胞在高滲條件下，大量合成甘油可以保護(hù)細(xì)胞不受損傷，在250 g/L 時(shí)，甘油含量是50 g/L時(shí)的3倍；但是隨著通氣量的增加，甘油的合成受到了抑制，這可能是由于較高的氧化環(huán)境不利于甘油途徑的進(jìn)行。甘油具有保護(hù)細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原水平等作用[20]，所以在一定程度上來(lái)說(shuō)，甘油的積累有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，但是在乙醇的生產(chǎn)工業(yè)中，甘油的合成分流了流向乙醇的碳源，降低了乙醇得率，同時(shí)在精餾過(guò)程中，甘油只能作為廢水排放，造成了碳源的浪費(fèi)[21]。

另一種副產(chǎn)物乙酸主要來(lái)自于乙醛或乙醇的氧化。乙酸也是隨著發(fā)酵過(guò)程的延長(zhǎng)而逐漸積累，但是與甘油相反，乙酸的產(chǎn)量隨著通氣量的增加而增高。這可能由于在高通氣條件下，流向甘油途徑的碳受到抑制，而流向乙醇、乙酸的碳增加。但是由表1結(jié)果來(lái)看，高通氣量降低了乙醇的得率，可能是由于部分乙醇在有氧條件下被氧化形成乙酸的原因。

3 討論

目前有關(guān)通氣量和底物濃度對(duì)K.marxinaus乙醇發(fā)酵和菊粉酶表達(dá)影響的研究并不多。我們的研究結(jié)果表明，相對(duì)厭氧和高底物濃度的條件不利于K.marxinaus YX01菊粉酶的分泌但有利于乙醇發(fā)酵，酶和乙醇的產(chǎn)率受通氣量影響顯著，隨通氣量增大，菊粉酶活力上升而乙醇得率隨之降低，這與Bernardo 等[15]的研究結(jié)果相似。較高的底物濃度嚴(yán)重抑制了菊粉酶活力但對(duì)乙醇得率影響不是很明顯，但是菊粉酶活力的降低，延長(zhǎng)了發(fā)酵時(shí)間，大大降低了乙醇生產(chǎn)效率[22]。

發(fā)酵過(guò)程副產(chǎn)物主要為乙酸和甘油，且與釀酒酵母乙醇發(fā)酵過(guò)程副產(chǎn)物的變化趨勢(shì)有相似之處[20]。實(shí)驗(yàn)證明，乙酸和甘油對(duì)菊粉酶活性沒(méi)有明顯抑制作用，但無(wú)疑副產(chǎn)物的產(chǎn)生降低了乙醇產(chǎn)量。發(fā)酵過(guò)程中，與乙醇對(duì)于細(xì)胞的毒害作用相比，副產(chǎn)物乙酸由于濃度相對(duì)較低，其毒害作用影響不大。

解決高效菊粉酶活力和高乙醇產(chǎn)量之間的矛盾是利用K.marxinaus 實(shí)現(xiàn)菊粉類(lèi)物質(zhì)CBP技術(shù)的關(guān)鍵。今后的研究工作可從以下兩個(gè)方面開(kāi)展：一是進(jìn)一步確定滿(mǎn)足菊粉酶高表達(dá)與乙醇高得率的通氣條件；二是找到調(diào)控菊粉酶表達(dá)的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，利用分子生物學(xué)的方法進(jìn)行改造，實(shí)現(xiàn)其在乙醇發(fā)酵條件下的可控表達(dá)。

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