自溶素（lytA）基因限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性用于肺炎鏈球菌鑒定的實(shí)驗(yàn)研究

溫玉蘭陳 會(huì)鄧林強(qiáng)胡錦輝張國(guó)強(qiáng)劉春風(fēng)

（1 南昌市第三醫(yī)院，江西 南昌 330000；2 江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330000；3 南昌市第二醫(yī)院，江西 南昌 330000）

自溶素（lytA）基因限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性用于肺炎鏈球菌鑒定的實(shí)驗(yàn)研究

溫玉蘭1陳 會(huì)2鄧林強(qiáng)2胡錦輝1張國(guó)強(qiáng)3劉春風(fēng)1

（1 南昌市第三醫(yī)院，江西 南昌 330000；2 江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330000；3 南昌市第二醫(yī)院，江西 南昌 330000）

目的 建立一種適用于臨床的、操作簡(jiǎn)單的、高特異性的肺炎鏈球菌分子生物學(xué)鑒定技術(shù)。方法 選取臨床分離的肺炎鏈球菌 102株及其他草綠色鏈球菌 51 株，分別采用 OPT 敏感試驗(yàn)、膽汁溶菌試驗(yàn)、商品化鑒定系統(tǒng)及自溶素基因片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)進(jìn)行鑒定。結(jié)果 102 株肺炎鏈球菌中 101 株 OPT 抑菌環(huán)直徑≥ 14mm，其中 17 株介于 14 ～ 19mm 之間，1 株為 OPT 耐藥肺炎鏈球菌，抑菌環(huán)僅6mm；102 株膽汁溶菌試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)鑒定準(zhǔn)確率為 93.1%。51 株草綠色鏈球菌中 19 株 OPT 出現(xiàn)抑菌環(huán)，其中 7 株抑菌環(huán)≥ 14mm；膽汁溶菌試驗(yàn)均為陰性。自溶素（lytA）基因限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性對(duì) 102 株肺炎鏈球菌鑒定準(zhǔn)確率為 100%，且能完全區(qū)分其它草綠色鏈球菌。結(jié)論 自溶素基因限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)肺炎鏈球菌鑒定具有很高的特異性和敏感性，臨床可作為傳統(tǒng)鑒定的方法學(xué)補(bǔ)充。

肺炎鏈球菌；自溶素；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性；鑒定

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae）是社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，亦與菌血癥、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎、角膜炎等相關(guān)，在世界上具有很高的發(fā)病率和病死率（尤其是老人和兒童）[1]?？焖?、準(zhǔn)確的肺炎鏈球菌鑒定有助于于及時(shí)、有效的診斷治療肺炎鏈球菌感染。本文采用PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)對(duì)肺炎鏈球菌及其他草綠色鏈球菌群的臨床分離株進(jìn)行研究，一方面試圖建立一種適用于臨床的、操作簡(jiǎn)單的、高特異性的肺炎鏈球菌分子生物學(xué)鑒定技術(shù)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法學(xué)及其他分子技術(shù)的不足，避免誤診誤治及抗生素濫用；另一方面，也為進(jìn)一步研究細(xì)菌感染性疾病的實(shí)驗(yàn)室分子診斷方法學(xué)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

①肺炎鏈球菌：共102株，其中100株為2009年1月至2010年12月間我院臨床分離，分別編號(hào)sp1～sp102。②其他草綠色鏈球菌：共51株，包括49株草綠色鏈球菌和2株呈草綠色溶血的糞腸球菌，編號(hào)sv1～sv51。③菌株保存 所有實(shí)驗(yàn)菌株初次分離后，采用5%哥倫比亞羊血瓊脂分純，接種于專用菌種保存培養(yǎng)基（Microbank管），-70° C凍存?zhèn)溆?。④質(zhì)控菌株：ATCC49619肺炎鏈球菌。

1.2 OPT敏感實(shí)驗(yàn)

對(duì)所有實(shí)驗(yàn)菌株均進(jìn)行OPT敏感試驗(yàn)，抑菌環(huán)直徑＞14mm為敏感。OPT紙片購(gòu)自英國(guó)OXIOD公司。

1.3 膽汁溶菌實(shí)驗(yàn)

對(duì)所有實(shí)驗(yàn)菌株均采用試管法進(jìn)行膽汁溶菌試驗(yàn)。分別取1mL 6麥?zhǔn)蠁挝痪河?個(gè)試管中，于1管菌液中加0.1 mL10%膽鹽溶液（去氧膽酸鈉），另一管中加0.1 mL無菌生理鹽水，混勻后，置35℃孵箱15 min取出，搖勻后觀察結(jié)果。加鹽水管菌液濁度不變（或基本不變），加膽鹽溶液管菌液變澄清，判為膽汁溶解試驗(yàn)陽性。

1.4 自動(dòng)化鑒定

采用美國(guó)BD公司phenix 100細(xì)菌全自動(dòng)鑒定藥敏系統(tǒng)對(duì)所有實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定，接種、孵育及結(jié)果判斷均嚴(yán)格按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 模板DNA提?。?xì)菌染色體DNA）

商品化試劑盒購(gòu)自X北京全式金生物技術(shù)有限公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5.2 引物設(shè)計(jì)

，選擇一對(duì)引物[18]，LA5-Ext：5'-AAGCTTTTTAGTCTG GGGTG-3'；LA3-Ext：5'-AAGCTTTTTCAAGACCTAATAATATG-3'，引物由北京全式金生物技術(shù)有限公司合成，每條引物合成后OD值均不＜5.0。采用這對(duì)引物無論是對(duì)肺炎鏈球菌或其他Smit群模板DNA PCR擴(kuò)增均可獲取長(zhǎng)1213bp的目的片段，且這一片段包含lytA基因（典型或不典型），見圖1。

1.5.3 PCR擴(kuò)增

總反應(yīng)體系體積50μL，含0.5UTaq酶，250μM DdNTP，引物L(fēng)A5-Ext及LA3-Ext各0.5μM，模板DNA0.5μg及標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。預(yù)變性95°C 5mins，隨后進(jìn)行25個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每個(gè)循環(huán)均為95°C變性30s-52°C退火30s-72°C延伸1min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，加3μL載樣緩沖液混勻，2%瓊脂糖凝膠電泳（90V，45mins），溴化乙錠染色，紫外燈下觀察，結(jié)合DNA Marker判斷目的片段。

圖1 lytA基因（典型和非典型序列）：數(shù)字1指啟動(dòng)編碼子ATG的第1位核苷酸；圖下方條形框代表非典型lytA基因6bp缺失所在位置；上方條形框代表典型lytA基因和非典型lytA基因102不同位點(diǎn)所在位置（22～927）；條形框內(nèi)5個(gè)綠色區(qū)域及區(qū)域內(nèi)數(shù)字分別代表不同位點(diǎn)集中區(qū)域及位點(diǎn)數(shù)

圖2 1：DNA Marker；2：OPT敏感的緩癥鏈球菌；3：口腔鏈球菌；4：肺炎鏈球菌ATCC 49619；5：OPT敏感株；6：OPT不敏感株

圖3 1：糞腸球菌；2：口腔鏈球菌；3：OPT敏感的緩癥鏈球菌；4：DNA Marker ；5：肺炎鏈球菌ATCC 49619；6：OPT敏感株；7：OPT不敏感株

圖4 OPT耐藥的肺炎鏈球菌

1.5.4 結(jié)果判斷

出現(xiàn)1213bp條帶為擴(kuò)增陽性（該菌株包含lytA基因），不出現(xiàn)為擴(kuò)增陰性（該菌株不含lytA基因）。見圖2。

1.5.5 擴(kuò)增陽性產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析

BsaAI酶及DNA Marker（分子量標(biāo)準(zhǔn)）均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。采用BsaAI 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，按試劑盒說明書進(jìn)行。取酶切后產(chǎn)物10μL，2%瓊脂糖凝膠電泳（90V，45mins），結(jié)合DNA Marker判斷。若出現(xiàn)761bp、452bp兩條帶即為典型的肺炎鏈球菌lytA基因；若出現(xiàn)362bp、851bp兩條帶則為不典型lytA基因（圖3所示）。

2 結(jié) 果

2.1 102株肺炎鏈球菌常規(guī)鑒定

2.1.1 102株肺炎鏈球菌OPT試驗(yàn)結(jié)果：肺炎鏈球菌sp1-sp101 OPT抑菌環(huán)均≥14mm，但其中有17株抑菌環(huán)介于14～19mm之間，sp102為OPT耐藥肺炎鏈球菌，抑菌環(huán)僅6mm（圖4）。

2.1.2 102株肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗(yàn)結(jié)果：102株肺炎鏈球菌膽汁溶菌試驗(yàn)均呈陽性。

2.1.3 102株肺炎鏈球菌自動(dòng)化鑒定結(jié)果：102株肺炎鏈球菌，95株鑒定為肺炎鏈球菌，鑒定準(zhǔn)確率為93.1%；3株鑒定錯(cuò)誤，其中2株報(bào)告為緩癥鏈球菌，1株為口腔鏈球菌；4株未能給出鑒定結(jié)果。

2.2 51株草綠色鏈球菌（含2株糞腸球菌）鑒定結(jié)果

2.2.1 51株草綠色鏈球菌OPT試驗(yàn)結(jié)果：51株草綠色鏈球菌有19株OPT出現(xiàn)抑菌環(huán)，其中7株抑菌環(huán)≥14mm。

2.2.2 51株草綠色鏈球菌膽汁溶菌試驗(yàn)結(jié)果：51株均呈現(xiàn)陰性。

2.2.3 51株草綠色鏈球菌自動(dòng)化鑒定結(jié)果：51株菌中，緩癥鏈球菌11株、口腔鏈球菌5株、血液鏈球菌8株、星座鏈球菌6株、唾液鏈球菌8株、咽峽炎鏈球菌4株、糞腸球菌2株、其它7株。

2.3 自溶素（lytA）基因限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性鑒定

2.3.1 對(duì)102株肺炎鏈球菌臨床分離株及肺炎鏈球菌ATCC49619，進(jìn)行PCR擴(kuò)增均可獲取1213bp片段，進(jìn)一步對(duì)所獲片段進(jìn)行BsaAI酶切，均可獲取761bp、452bp目的片段（圖3）。

2.3.2 對(duì)51株草綠色溶血鏈球菌進(jìn)行上述相同PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅SMG群鏈球菌（緩癥鏈球菌11株、口腔鏈球菌5株）出現(xiàn)1213bp目的片段，其余35株（包括2株糞腸球菌）均未能獲取目的片段，對(duì)未能獲取目的片段的菌株依據(jù)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)鑒定為非肺炎鏈球菌。對(duì)16株SMG群鏈球菌擴(kuò)增所獲片段進(jìn)行BsaAI酶切，均獲取362bp、851bp目的片段，依據(jù)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，鑒定為非肺炎鏈球菌（圖3）。

3 討 論

目前臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)肺炎鏈球菌鑒定主要依賴于其四個(gè)主要的表型特征[3]：血瓊脂平板上菌落特點(diǎn)（臍窩狀，草綠色溶血）、Optochin紙片敏感實(shí)驗(yàn)（OPT）、膽汁（去氧膽酸鹽）溶菌實(shí)驗(yàn)（BS）、免疫學(xué)反應(yīng)（型特異性抗血清反應(yīng)、莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)）及自動(dòng)化鑒定系統(tǒng)。其中，前三種尤其是OPT實(shí)驗(yàn)為臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定肺炎鏈球菌常用手段。由于方法學(xué)局限及肺炎鏈球菌生物學(xué)變異，僅憑借上述方法可能使部分菌株的鑒定出現(xiàn)錯(cuò)誤。

一些肺炎鏈球菌，如果培養(yǎng)時(shí)間不足或培養(yǎng)前抗生素的使用，則不具備典型的菌落形態(tài)，若分離有菌部位如呼吸道標(biāo)本，很難與其它草綠色鏈球菌相區(qū)別；optochin試驗(yàn)，抑菌環(huán)直徑≥14 mm 為敏感，肺炎鏈球菌的抑制環(huán)直徑常在20mm以上。草綠色溶血性鏈球菌（約98%）＜12mm。一般來說，通過optochin藥敏試驗(yàn)，肺炎鏈球菌可得到準(zhǔn)確鑒定。但optochin耐藥的肺炎鏈球菌菌株已經(jīng)出現(xiàn)[4]，此外，optochin對(duì)草綠色溶血性鏈球菌部分菌種也呈現(xiàn)抑菌作用，抑菌環(huán)多在14～17mm，本研究中51株草綠色鏈球菌有16株OPT出現(xiàn)抑菌環(huán)，其中7株抑菌環(huán)≥14mm；膽汁溶菌試驗(yàn)，膽汁不溶的肺炎鏈球菌已有報(bào)道，一些肺炎鏈球菌菌落膽汁不溶甚至同時(shí)表現(xiàn)BS陰性和OPT耐藥，而且即便是方法改進(jìn)，BS實(shí)驗(yàn)的敏感性僅能達(dá)到98%[5]；免疫學(xué)反應(yīng)基于肺炎鏈球菌莢膜抗原與特異性抗血清之間的凝集反應(yīng)，然而一些肺炎鏈球菌不存在莢膜，則可能導(dǎo)致假陰性，另外，抗血清可能與一些非肺炎鏈球菌的草綠色鏈球菌群存在交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果[6]；隨著科技進(jìn)步，細(xì)菌鑒定手段不斷豐富，以生化表型為基礎(chǔ)的自動(dòng)、半自動(dòng)鑒定系統(tǒng)已成為各級(jí)臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用手段。但是，由于方法學(xué)局限及一些技術(shù)原因，對(duì)于肺炎鏈球菌的鑒定，均未能達(dá)到滿意效果，本研究中，102株肺炎鏈球菌，95株鑒定為肺炎鏈球菌，鑒定準(zhǔn)確率為93.1%；3株鑒定錯(cuò)誤，其中2株報(bào)告為緩癥鏈球菌，1株為口腔鏈球菌；4株未能給出鑒定結(jié)果。

因此，上述問題的存在，一方面導(dǎo)致部分肺炎鏈球菌感染漏診，耽誤患者病情；另一方面，也可能將一些非肺炎鏈球菌的草綠色鏈球菌群錯(cuò)誤地鑒定為肺炎鏈球菌，如此則可能誤導(dǎo)臨床用藥，加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)導(dǎo)致出現(xiàn)不客觀的相關(guān)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)資料[肺炎鏈球菌耐藥率及PRSP（penicillin resistant streptococcus pneumonia，耐青霉素肺炎鏈球菌）的發(fā)生率]假性增高。因此，尋找一種快速準(zhǔn)確的肺炎鏈球菌鑒定技術(shù)具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的迅猛發(fā)展，肺炎鏈球菌遺傳物質(zhì)的特點(diǎn)逐漸被闡明，使得采用分子生物學(xué)手段對(duì)肺炎鏈球菌進(jìn)行鑒定成為當(dāng)前這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究者們采用多種分子手段進(jìn)行了研究：①采用PCR手段擴(kuò)增肺炎鏈球菌毒力因子自溶素（autolysin，lytA）、溶血素（pneomolysin，ply）和青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding protein，PBP）編碼基因[7-9]；②對(duì)肺炎鏈球菌16S rRNA 基因（16S rDNA ）的特異性區(qū)域進(jìn)行DNA探針雜交[10]；③肺炎鏈球菌看家基因如xpt，recP，HexB，ddl以及錳依賴的超氧化物歧化酶基因（sodA）PCR擴(kuò)增[11-14]；④DNA-DNA reassociation，一種基于DNA雜交的鑒定技術(shù)，對(duì)于肺炎鏈球菌典型菌株，其DNA-DNA相似值超過70%，而其他Smit群如緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌與肺炎鏈球菌比較，基因組DNA-DNA之間相似值＜60%[15]。這些分子技術(shù)用于肺炎鏈球菌鑒定都曾被認(rèn)為是可靠的、充分的手段，但隨著研究的深入，這些方法的局限性和不足亦越來越明確。首先，有報(bào)道[13,14]認(rèn)為除肺炎鏈球菌外的其他Smit群成員也具有l(wèi)ytA基因或具有l(wèi)ytA基因相似的基因片段，因此，單純依賴PCR擴(kuò)增確定lytA基因存在與否鑒定肺炎鏈球菌會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；其次，Kawamura等[15]和Whatmore 等[14]均報(bào)道一些緩癥鏈球菌和口腔鏈球菌分離株基因組也包含ply基因，即便是檢測(cè)到ply基因也無法準(zhǔn)確區(qū)分肺炎鏈球菌和其他 Smit群成員；16S rRNA 基因序列用于肺炎鏈球菌鑒定也具有一定的局限性，Smit群內(nèi)不同種之間具有遺傳相似性，DNA-DNA同源性研究表明，Smit群內(nèi)不同成員之間DNA相似性達(dá)40%～60%，且典型的緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌和肺炎鏈球菌菌株的16S rRNA基因之間的同源性高達(dá)99%以上，因此DNA探針雜交檢測(cè)16S rRNA 基因也無法準(zhǔn)確鑒定肺炎鏈球菌[10-14]；此外，雖然DNA-DNAreassociation技術(shù)被認(rèn)為是鑒定菌株至種的一種金標(biāo)準(zhǔn)，是區(qū)分Smit群內(nèi)不同種的一種最為精準(zhǔn)的手段，然而由于技術(shù)難度大，操作煩瑣，不可能作為臨床實(shí)驗(yàn)室的常用手段。

最近，Llull等[2]從EMBL數(shù)據(jù)庫上公布的不同分離株的lytA基因序列數(shù)據(jù)中，選擇一些完整或接近完整的序列（至少包含第22位核苷酸～第957位核苷酸[約占總基因長(zhǎng)度95%]）。共獲取29株肺炎鏈球菌和22株其他Smit群細(xì)菌的lytA序列，并對(duì)其中19株肺炎鏈球菌和20株其他Smit群細(xì)菌的lytA序列進(jìn)行詳細(xì)的比較分析，得出如下結(jié)論：①證實(shí)了前人研究成果，即典型的lytA基因序列（肺炎鏈球菌）長(zhǎng)度為957bp，而非典型的lytA基因序列（其他Smit群）長(zhǎng)度為951bp，非典型lytA基因在第868位核苷酸～第873位核苷酸之間存在6bp的缺失（圖1）；②典型的lytA基因序列和非典型的lytA基因序列之間，共有102個(gè)位點(diǎn)（包括上述6bp 缺失）呈現(xiàn)不同，而且這些位點(diǎn)均集中在第22～927位核苷酸之間的5個(gè)不同區(qū)域內(nèi)（圖1）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，典型的lytA基因序列中包含SnaBI酶切位點(diǎn)（酶切位置位于第561和562位核苷酸之間），而這一位點(diǎn)在非典型的lytA基因序列中并不存在（圖1）；相反，非典型lytA基因序列中包含XmnI酶切位點(diǎn)（酶切位置位于第290和291位核苷酸之間），而這一位點(diǎn)在典型的lytA基因序列中并不存在；此外由于SnaBI酶切位點(diǎn)（TAC↓GTA）同時(shí)也是BsaAI的酶切位點(diǎn)（PyAC↓GTPu），對(duì)非典型lytA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，所有的序列均僅在160～165位核苷酸之間存在一個(gè)BsaAI的酶切位點(diǎn)。lytA基因序列（典型和非典型）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性特點(diǎn)的明確，使得采用PCR結(jié)合限制性酶切技術(shù)很容易將典型的lytA基因（肺炎鏈球菌）和非典型lytA基因（其他Smit群）區(qū)分開來。迄今為止，除Llull等外，國(guó)內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究利用這一研究成果，對(duì)分離自臨床的102株肺炎鏈球菌及肺炎鏈球菌ATCC49619進(jìn)行鑒定，所有菌株經(jīng)過PCR擴(kuò)增均能獲取1213bp的DNA片段，選用BsaAI進(jìn)行酶切，均能獲取761bp、452bp兩個(gè)DNA片段，依據(jù)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，鑒定率為100%。對(duì)51株草綠色溶血性鏈球菌進(jìn)行同樣操作，其中35株（包括兩株糞腸球菌）PCR未能獲取目的片段，16株SMG群（11株緩癥鏈球菌和5株口腔鏈球菌）PCR可獲取1213bpDNA片段，但經(jīng)過BsaAI進(jìn)行酶切后獲取的兩個(gè)目的片段分別為362bp、851bp。依據(jù)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，均為非肺炎鏈球菌。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Llull等的觀點(diǎn)，并為將之廣泛應(yīng)用于臨床打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

綜上所述，自溶素基因限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)肺炎鏈球菌鑒定具有很高的特異性和敏感性，優(yōu)于其他分子生物學(xué)鑒定技術(shù)。其操作相對(duì)簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)及設(shè)備要求不高，臨床可常規(guī)開展作為肺炎鏈球菌傳統(tǒng)鑒定方法學(xué)的補(bǔ)充。

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R378.1+2

：B

：1671-8194（2013）04-0097-04