GDF-15基因-3148C/G位點多態(tài)性與冠心病風(fēng)險的相關(guān)性分析

尚小森陳小平馬云霞李鵬麗

（1 山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院內(nèi)科學(xué)研究生，山西 太原 030001；2 太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030009；3 太原市中心醫(yī)院中心實驗室，山西 太原 030009）

GDF-15基因-3148C/G位點多態(tài)性與冠心病風(fēng)險的相關(guān)性分析

尚小森1陳小平2馬云霞3李鵬麗3

（1 山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院內(nèi)科學(xué)研究生，山西 太原 030001；2 太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030009；3 太原市中心醫(yī)院中心實驗室，山西 太原 030009）

目的 探討 GDF-15 基因 -3148C/G 位點多態(tài)性與山西地區(qū)漢族人群中冠心病發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng) -限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）的方法對 118 例冠心病患者和 56 例健康對照者 GDF-15 基因 -3148C/G 位點進行多態(tài)性分析。結(jié)果 在冠心病組中，CC、GC 兩種基因型頻率分別為 76.27% 和 23.73%，在正常對照組中分別為 60.71% 和 39.29%；兩組受試者 -3148C/G 位點的 CC、GC 基因型頻率分布有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.488，P=0.034）；風(fēng)險基因型為 GC 型，OR=2.080，95% 可信區(qū)間為 1.050 ～ 4.121。結(jié)論 GDF-15 基因 -3148C/G 位點中 GC 基因型與山西地區(qū)漢族人群中冠心病的發(fā)病風(fēng)險存在一定的相關(guān)性。

冠心病；生長分化因子 -15（GDF-15）；基因多態(tài)性；聚合酶鏈反應(yīng) -限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）

隨著我國人口老齡化及生活方式的改變，冠心病已成為嚴重威脅人類健康的疾病之一。生長分化因子-15（GDF-15）的基因定位于染色體19p12～13.1，由兩個外顯子組成，被一個長約1800個堿基對的內(nèi)含子分隔開來[1]。近年來，GDF-15基因在心血管疾病領(lǐng)域已有初步研究，Wang[2]于2007年發(fā)現(xiàn)GDF-15基因-3148C/G多態(tài)性與左心室重塑相關(guān)，但GDF-15基因-3148C/G位點多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性報道甚少。

本研究以冠心病患者為主要研究對象，對GDF-15基因-3148C/G位點多態(tài)性進行檢測，從分子水平上探索GDF-15基因-3148C/G多態(tài)性與山西地區(qū)漢族人群中冠心病的發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

2012年1月至2012年12月間，于太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科病房住院行冠脈造影并診斷冠心病的患者作為冠心病組即實驗組，簽署知情同意書，在冠脈造影的同時采取動脈血標(biāo)本。同期進行健康體檢者作為對照組。

排除有急、慢性炎癥性疾病的臨床或?qū)嶒炇冶憩F(xiàn)者；腫瘤性疾??；瓣膜疾病、心肌??；無固定冠脈狹窄的變異性心絞痛；X綜合征；冠狀動脈擴張；嚴重的腎臟疾?。ㄑ狢R＞2.5mg/dL）；嚴重的肝臟疾?。ˋLT高于正常水平2倍）。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動脈造影及側(cè)枝血管評判

按Judkins 法行選擇性冠狀動脈造影。任何主要冠狀動脈（左主干、左前降支、右冠狀動脈、回旋支、主要的對角支或鈍緣支）的管腔直徑狹窄50%以上為有意義的冠脈狹窄。

1.2.2 實驗分組

所有受試者分為冠心病組和正常對照組。冠脈造影檢查冠脈管腔直徑狹窄50%以上作為實驗組118例；同期進行健康體檢者作為對照組56例。

1.2.3 DNA的提取

采集患者靜脈外周血2～4mL，EDTA-K2抗凝，用全血基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取全血基因組DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR擴增

查閱相關(guān)文獻設(shè)計GDF15基因引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為：-3148C/G F：5'-AGTGAGTCCTTGTGTCTCT TAC-3'；R：5'-GCAGGCTGGTGTAGAGTC-3'。擴增體系：體系總體積為40μL，其中10×Buffer 4μL，MgCl2 3μL，dNTP（2.5mM）4μL，上下游引物（10μM）各2μL，Taq 酶（1U）2μL，DNA模板2μL，ddH2O 21μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)；72℃ 7min。取5μL PCR產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果，PCR擴增產(chǎn)物10μL進行酶切，其余25μL送上海生工測序。

1.2.5 酶切及產(chǎn)物鑒定

圖2 冠心病組中-3148位點基因型（a：GC 基因型；b：CC 基因型）

圖3 對照組中-3148位點基因型（a：GC基因型；b：CC基因型）

PCR產(chǎn)物于59℃12h酶切。反應(yīng)體系：總體積為20μL，其中PCR產(chǎn)物10μL，10×Buffer 2μL，BsrI限制性內(nèi)切酶0.5μL。取15μl加有10×loding buffer的酶切產(chǎn)物，加樣至含有溴化乙錠的2.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像儀分析酶切結(jié)果。

1.2.6 序列比對

測序結(jié)果采用DNAMAN以及Chromas生物軟件進行分析。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差表示，應(yīng)用t檢驗；基因型分布是否符合Hardy Weinberg 遺傳平衡定律以及組間基因頻率、等位基因比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本資料

所有受試者基本資料（年齡、性別、吸煙史、高脂血癥、高血壓病、糖尿病、家族史）見表1。經(jīng)卡方檢驗，冠心病組和對照組差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 基線資料比較

表2 兩組受試者GDF-15基因-3148C/G位點基因頻數(shù)和等位基因頻率比較

2.2 GDF-15基因的Hardy Weinberg 遺傳平衡定律檢驗

經(jīng)χ2檢驗，兩組受試者GDF-15基因的-3148C/G位點均符合Hardy Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），具有群體代表性。

2.3 PCR擴增及酶切結(jié)果分析

GDF-15基因PCR擴增產(chǎn)物大小為251bp，CC型酶切產(chǎn)物大小為251bp，GC型酶切產(chǎn)物大小為251bp、191bp、60bp（圖1）；經(jīng)統(tǒng)計,在冠心病患者中CC型和GC型分別為90例和28例，正常健康者中CC型和GC型分別為34例和22例。

圖1 GDF-15基因-3148C/G酶切結(jié)果M：DL500 DNA marker；1：PCR擴增產(chǎn)物；2：CC基因型；3：GC基因型

2.4 序列比對結(jié)果

采用DNAMAN和Chromas生物軟件對測序結(jié)果進行分析，測序結(jié)果與酶切結(jié)果一致，在實驗組中存在GC型和CC型（圖2），同樣，在對照組中也存在該兩種基因型（圖3）。

2.5 實驗組與對照組受試者GDF-15基因-3148C/G位點基因型分布頻率及等位基因頻率的比較（表2）

CC、GC基因型頻率在實驗組中分別為76.27%、23.73%；在對照組中分別為60.71%、39.29%；兩組受試者的-3148C/G位點的CC、GC基因型頻率分布有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.488，P=0.034）；但兩組C、G等位基因頻率比較無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.389，P=0.122）。風(fēng)險基因型為GC型，OR=2.080，95%可信區(qū)間為1.050～4.121，對于兩組的基因型分布而言，-3148C/G位點的GC基因型有顯著增加患冠心病的風(fēng)險。

3 討 論

冠心病是世界范圍內(nèi)致病率和致死率居首位的復(fù)雜性疾病，在我國每年死于冠心病超過70萬人。冠心病是由于動脈粥樣硬化引起血管狹窄、冠狀動脈供血不足導(dǎo)致心肌功能障礙和器質(zhì)性病變，該過程由遺傳因素和壞境因素共同導(dǎo)致。但國內(nèi)關(guān)于冠心病的遺傳因素報道甚少。目前大量研究表明GDF-15不但參與心肌缺血的發(fā)生發(fā)展過程，而且能夠減輕由此引起的心肌損傷，發(fā)揮保護性作用。GDF-15在正常的心肌細胞中不表達，在心肌細胞局部缺血和再灌注，或壓力負荷過重等應(yīng)激狀態(tài)下，在心肌細胞表達增高[3]。GDF-15是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成員之一[4]。起初，人們發(fā)現(xiàn)GDF-15參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，調(diào)控腫瘤的生長，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[5]。近來，研究表明GDF-15還是一個重要的心血管保護因子。雖然心臟在正常情況下不表達GDF-15，但是當(dāng)心臟處于多種病理狀態(tài)，如后負荷升高刺激、缺血/再灌注損傷時，GDF-15在心肌細胞被迅速誘導(dǎo)高表達[6,7]。成熟的GDF-15蛋自被分泌到細胞外后，與心肌細胞表面TGF-β家族受體結(jié)合，激活A(yù)kl、SMAD等下游信號通路，反饋抑制心肌的損傷[7]。

由此可知，GDF-15與冠心病的關(guān)系密切。近年來，GDF-15基因多態(tài)性在心血管領(lǐng)域已有研究，2007年，Wang[3]報道了GDF-15基因-3148C/G位點多態(tài)性與高血壓患者左心室重塑之間的相關(guān)性。但對于該位點與冠心病之間的相關(guān)性報道甚少。

本研究以山西地區(qū)漢族人群中冠心病患者118例以及同期進行健康體檢者56例為研究對象，采用病例對照研究設(shè)計探討GDF-15基因-3148C/G位點多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險之間的關(guān)系，實驗觀察到：-3148C/G位點的實驗組和對照組均檢出兩組基因型，即CC和GC，經(jīng)統(tǒng)計證明，CC、GC基因型在實驗組和正常對照組中差異有顯著性（P＜0.05），其中CC基因型為正常野生型基因，GC基因型可能是冠心病患病的危險因素，攜帶有GC基因型的人群患冠心病的風(fēng)險比CC基因型者升高2.080倍，但本研究中，兩組-3148位點的等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能是本研究樣本量較少，并不能代表整個山西地區(qū)人群的基因分布情況，仍需加大樣本量做進一步的研究。

綜上所述，GDF-15基因-3148C/G位點的多態(tài)性與冠心病的發(fā)病相關(guān)，其中GC基因型與該病的發(fā)病關(guān)系更為緊密，可作為預(yù)測冠心病患病的生物學(xué)指標(biāo)。但樣本含量相對較少，具有一定的局限性，因此并不一定能真實的代表整個山西地區(qū)漢族人群中該多態(tài)性位點與冠心病發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，有待擴大樣本后進一步驗證。

[1]Lawton LN,Bonaldo MF,Jelenc PC,et al.Identification of a novel member of the TGF-beta superfamily highly expressed in human placenta[J].Gene,1997,203(1):17-26.

[2]王曉建.生長分化因子15的基因多態(tài)保護原發(fā)性高血壓患者左心室重塑[J].中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)[D].2007.

[3]Kempf T,Eden M,Strelau J,et al.The transforming growth factor-? super family member growth-differentiation factor-15 protects the heart from ischemia/reperfusion injury[J].Circ Res,2006,98(3): 351-360.

[4]BootcovMR,Bauskin AR,Valenzuela SM,et al.MIC-l,a novel macrophage inhibitory cytokine,is a divergent member of the TGF-βsuper family.[J]Pro Natl Acad Sci USA,1997:94(21):11514-11519.

[5]Bauskin AR,Brown DA,Kuffner T.et al.Role of macrophage inhibitory cytokine-1 tumorigenesis and diagnosis of cancer[J].Cancer Res,2006,66(10):4983-4986.

[6]Xu J,Kimball TR,Lorenz JN,et al.GDF15/MIC-1 functions as a protective and antihypertrophic factor released from the myocardium in association with SMAD protein activation[J].Circ Res, 2006,98(3):342-350.

[7]Zimmers TA,Jin X,Hsiao EC,et al.Growth differentiation factor-15/macrophage inhibitory cytokine-1 induction after kidney and lung injury[J].Shoek,2005:23(6):543-548.

Correlation of GDF-15 Gene -3148C/G Polymorphism and the Risk of Coronary Heart Disease

SHANG Xiao-sen1, CHEN Xiao-ping2, MA Yun-xia3, LI Peng-li3
(1 Graduate of Heart Diseases, Graduate Department, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2 Department of Cardiology, Taiyuan Central Hospital, Taiyuan 030009, China; 3 Department of Laboratory, Taiyuan Central Hospital, Taiyuan 030009, China)

ObjectiveThis study is to explore the correlation between polymorphism of -3148C/G site of GDF15 gene and the risk of coronary heart disease(CHD) in Shanxi Han people.MethodsThe polymerase chain reaction (PCR )、gene sequencing and sequence flanking were used to detect and analyze the polymorphism of -3148C/G site of GDF-15 gene for 118 cases CHD patients as experimental group and 56 cases patients as control group.ResultsThe genotype frequencies of CC、GC were 76.27% and 23.73% in the CHD group and in the control group were 60.71% and 39.29% respectively. Testers of the two groups at -3148C/G CC, GC genotype frequencies distribution have a statistics mean (χ2=4.488,P=0.034);The risk genotype was GC, OR=2.080, 95% of confident interval is 1.050-4.121.ConclusionsWe conclude that there is a correlation between the polymorphism of -3148C/G site in GDF15 gene and the risk of CHD patients in Shanxi Han people.

Coronary heart disease(CHD); GDF-15; Gene polymorphisms ; PCR-RFLP

R541.4

：B

：1671-8194（2013）04-0030-03