初步探討中國廣東人群的中性粒細胞CD177基因型和HNA-2a的表達①

徐秀章 夏文杰 葉 欣 丁浩強 陳揚凱 鄧 晶 邵 媛 王嘉勵

(廣州血液中心臨床輸血研究所，廣州 510095)

人類中性粒細胞除表達人類白細胞抗原、紅細胞ABH抗原等共有抗原外，還表達特有的糖蛋白，稱為中性粒細胞抗原(Human neutrophil antigen，HNA)。自1960年 Lalezari［1］發(fā)現(xiàn)首個人類中性粒細胞抗原以來，目前已檢出并命名了HNA1～5系統(tǒng)中的8個HNA抗原。研究證明［2］，中性粒細胞抗原在中性粒細胞的免疫激活和輸血相關(guān)性疾病方面起著重要作用，其抗體可導致多種臨床病癥，如同種免疫性中性粒細胞減少癥、自身免疫性中性粒細胞減少癥、藥物依賴性中性粒細胞減少癥、骨髓移植后移植物被排斥及輸血相關(guān)性急性肺損傷(TRALI)。在HNA系統(tǒng)中，人類中性粒細胞抗原－2a(HNA－2a)因其臨床重要性而受到廣泛關(guān)注。

HNA－2a之前被稱為 NB1，由 19號染色體19q13．3區(qū)域的 CD177基因編碼，分子量為56－64 kD。CD177基因的cDNA由1 311個堿基組成，編碼437個氨基酸，其中包括21個氨基酸的信號肽［3］。NB1糖蛋白屬于LY6基因家族，且與Ly－6基因家族的另一成員PRV－1具有高度的同源性，目前已被證實是一對等位基因［4］。PRV－1基因在真性紅細胞增多癥患者的中性粒細胞上大量表達，且與NB1基因之間存在4個堿基的區(qū)別，其中外顯子1第42位置上的堿基取代決定HNA－2a系統(tǒng)的抗原特異性，故多通過該位置對中性粒細胞的CD177進行基因分型。HNA－2a是一種高頻率抗原，其中在97%的高加索人、95%的非裔美國人及99．5%的日本中表達［4－7］。有3% ～5%的健康人表達非常低的HNA－2a，甚至有極少部分表達量＜5%，稱為 HNA－2－null型。目前認為 HNA－2－null型的產(chǎn)生與 mRNA合成過程中的剪切錯誤有關(guān)［2］。在HNA－2a表達陽性的個體中，并非所有的中性粒細胞都表達HNA－2a。在0%－100%范圍內(nèi)的中性粒細胞有不同程度的 HNA－2a 表達(55% ±22%)［8］，且其表達量受多種因素的影響，研究發(fā)現(xiàn) CD177基因的 SNPs與HNA－2a的表達水平相關(guān)。

本研究旨在通過PCR－SBT方法對中性粒細胞CD177(G42C)基因型進行檢測，獲得中國廣東人群的CD177的基因型;同時也采用流式細胞技術(shù)檢測該人群HNA－2a的表達，結(jié)合其基因型對可能影響HNA－2a表達的幾個因素(SNPs、年齡及性別)進行初步探討。

1 對象與方法

1．1 研究對象 隨機抽取83份體檢正常的無血緣關(guān)系的廣東籍無償獻血者，其中男53例，女30例，年齡介于20～54歲。每例標本抽取EDTA抗凝血10 ml。

1．2 主要儀器和材料 淋巴細胞分離液(密度ρ:1．077±0．002)購自上海華精生物高科技有限公司;DPBS購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司;CD177－FITC(MEM－166)和鼠抗 IgG－FITC 抗體均購自美國BioLegend公司;EPICS－XL流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司;MJPTC－200PCR擴增儀;全血DNA提取試劑盒(購自德國QIAGEN公司);凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP);3130測序儀(購自美國ABI公司)。

1．3 方法

1．3．1 中性粒細胞分離 將2 ml生理鹽水加入新鮮采集的全血中，混勻，再緩慢加入4 ml的淋巴細胞分離液中，2 000 r/min，離心20分鐘。棄上層血清及淋巴細胞，洗滌后加入1×氯化銨溶血素，冰上裂解5分鐘，1 500 r/min離心5分鐘，如紅細胞裂解不充分，可進一步裂解。用DPBS洗滌2次后，用1 ml的0．2%BSA/DPBS重懸，上機計數(shù)并將中性粒細胞的濃度調(diào)整為 3×106ml－1。

1．3．2 流式細胞儀檢測 分別取1．3．1中的粒細胞懸液100μl加入到兩支FACS管中，一管再加入2μl的MEM－166，另一管加入2μlm IgG(每個樣本均設(shè)有對照管)，4℃避光孵育20分鐘。之后加入2．5 ml的 0．2%BSA/DPBS，以 1 500 r/min 離心 5分鐘，棄上清。最后用300μl的0．2%BSA/DPBS重懸細胞，上機讀數(shù)。

1．3．3 基因組 DNA提取 EDTA抗凝靜脈血5 ml，按試劑盒提取DNA(詳細步驟見QIAGEN DNA提取試劑盒說明書)，－20℃保存。

1．3．4 PCR擴增及測序 合成PCR擴增引物:5HNA－2a:5'－GAGAGATTACCAGCCACAGACG－3';3HNA－2a:5'－GCACAGGGATCAAGGGAC－3'。 擴 增條件為94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性30秒，63℃退火30秒和72℃延伸30秒，共30循環(huán)，72℃最后延伸5分鐘后冷卻至4℃。對擴增的PCR產(chǎn)物進行酶切純化后，將擴增引物作為測序引物進行測序PCR，反應(yīng)條件如下:96℃預(yù)變性2分鐘，96℃變性10秒，50℃退火5秒和60℃延伸4分鐘，共25循環(huán)。純化變性后上機測序。

1．4 統(tǒng)計學分析 用SPSS13．0軟件進行統(tǒng)計學分析。對83例CD177基因型測序結(jié)果和HNA－2a表達量的流式檢測結(jié)果進行T－檢驗和單因素方差分析，若P＜0．05，認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 廣東人群中中性粒細胞HNA－2a的表達與年齡及性別的關(guān)系 通過流式細胞術(shù)對83名廣東籍無償獻血者HNA－2a的表達進行檢測，其表達量均超過5%(HNA－2a表達量低于5%，認為HNA－2a表達陰性)。HNA－2a在83例獻血者的中性粒細胞表達的百分比為61．37%±17．87%，MFI為4．87±1．41(見表 1、圖 1)。對不同性別及女性不同年齡段(≥40歲者與＜40歲者)HNA－2a的表達量進行T－檢驗，P＞0．05，統(tǒng)計結(jié)果表明，男性與女性對HNA－2a的表達無明顯差異，且女性隨著年齡的增加對HNA－2a的表達量亦無明顯影響。

表1 不同性別及年齡對HNA-2a表達的影響Tab．1 The effects of gender and age on HNA-2a expression in Guangdong population

表2 CD177的基因型及HNA-2a流式表達結(jié)果Tab．2 CD177 genotype and the results of HNA-2a exp ression by flow cytometry

2．2 中國廣東人群 CD177的基因型及 SNPs對HNA－2a表達的影響 根據(jù)CD177基因在1號外顯子42位的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，采用PCR－SBT法對83份標本的 CD177進行基因分型，表現(xiàn)為42C/C、42C/G和42G/G三種基因型，其中42C/C與42C/G為中國廣東人群中常見的CD177基因型，分別占48．19%與44．58%;而42G/G較少見，僅占7．23%(見表2、圖2)。

此外，對不同基因型的無償獻血者 HNA－2a的表達量進行單因素方差分析(見表2)，統(tǒng)計顯示，42C/C與42G/G基因型之間，其 HNA－2a表達的MFI存在顯著影響(P=0．047＜0．05)，表明 G42C 基因多態(tài)性可影響HNA－2a的表達。

3 討論

圖1 HNA-2a表達的流式細胞分析結(jié)果Fig．1 Flow cytometry of HNA-2a expression

圖2 HNA-2a基因分型測序結(jié)果Fig．2 The genotype of HNA-2a analyzed by nucleotide sequencing

HNA－2a作為GPⅠ連接膜糖蛋白僅表達于中性粒細胞亞群［9，10］，且表達存在明顯的個體差異。研究認為可能與以下兩個機制有關(guān)［4，11－15］:一，機體狀態(tài)的影響，激素、炎癥、感染、接受G－CSF治療及骨髓增生性疾病等因素可影響CD177的基因調(diào)控和蛋白加工，從而導致HNA－2a表達增加。據(jù)文獻報道HNA－2a在中性粒細胞的表達，女性高于男性，特別是妊娠期婦女HNA－2a中性粒細胞數(shù)明顯增加［12］。二，基因水平的影響，CD177是一個多態(tài)性基因，一些高頻的SNPs可能會影響到中性粒細胞表面的蛋白表達，例如 G42C。A793C及 G1084A等，其中最常見的SNPs為G42C，單核苷酸其多態(tài)性使得參與細胞從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到質(zhì)膜和次級顆粒進行蛋白搬運的前導序列的氨基酸發(fā)生改變，從而影響到細胞表面蛋白質(zhì)的表達量［16］。

本研究首先采用流式細胞術(shù)檢測中國廣東人群HNA－2a的表達，發(fā)現(xiàn) 83例無償獻血者均表達HNA－2a 抗原，其表達量為61．37% ±17．87%。本實驗也對HNA－2a在不同性別及女性的不同年齡段的表達量進行相關(guān)性分析，統(tǒng)計結(jié)果顯示女性與男性之間HNA－2a的表達量無差異，且 HNA－2a在≥40歲與＜40歲女性中性粒細胞之間的表達無明顯區(qū)別，此與之前文獻報道的不一致［12］。分析原因可能與本實驗樣本量少有關(guān);亦或者雌激素并不影響HNA－2a的表達。其次，通過對83名健康無償獻血者CD177基因(G42C)進行測序分析，獲得中國廣東人群基因型結(jié)果是42C/C和42C/G多見，而42G/G 少見，分別占 48．19%、44．58%和 7．23%。而Caruccio等［4］得到的實驗結(jié)果是42G/G與42C/C 多見，42C/G 較少見，分別占50．00%、43．75%及6．25%，兩者結(jié)果存在很大差異，分析原因可能與人種不同有關(guān)。因為本研究著眼于位于中國南方地區(qū)的廣東人群，而Caruccio等研究人群則由11名非裔美國人和12名高加索人組成，兩者在人種遺傳和地域等方面存在很大差距，故初步推測中國廣東人群CD177基因的G42C存在其獨特性。本研究亦分析CD177基因的G42C多態(tài)性對HNA－2a表達量的影響，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，42C/C基因型獻血員其HNA－2a表達的MFI明顯高于42G/G基因型者(P＜0．05)，表明SNPs(G42C)會影響HNA－2a的表達量。

總之，NB1作為最重要的中性粒細胞抗原之一是目前輸血免疫領(lǐng)域研究的熱點，其臨床重要性在國外得到廣泛地關(guān)注，但國內(nèi)對HNA－2a的研究甚少。本研究通過PCR－SBT方法和流式細胞術(shù)，獲得了中國廣東人群CD177的基因型及HNA－2a的表達情況，并對影響HNA－2a表達的幾個因素進行了初步探討，這對今后對NB1功能研究及由NB1引起的臨床輸血相關(guān)性疾病的研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 Lalezari P，Nussbaum M，Gelman S et al．Neonatal neutropenia due tomaternal isoimmunization［J］．Blood，1960;15(2):236－243．

2 Bux J．Human neutrophil alloantigens［J］．Vox Sang，2008;94(4):277－285．

3 Kissel K，Scheffler S，Kerowgan M et al．Molecular basis of NB1(HNA－2a， CD177)deficiency［J］． Blood，2002;99(11):4231－4233．

4 Caruccio L，Walkovich K，BettinottiM etal．CD177 polymorphisms:correlation between high－frequency single nucleotide polymorphisms and neutrophil surface protein expression［J］．Transfusion，2004;44(1):77－82．

5 Bux J．Molecular genetics of granulocyte polymorphisms［J］．Vox Sang，2000;78(Suppl 2):125－130．

6 Taniguchi K，KobayashiM，Harada H et al．Human neutrophil antigen－2a expression on neutrophils from healthy adults in western Japan［J］．Transfusion，2002;42(5):651－657．

7 Moritz E，Chiba A K，Yamamoto M etal．Human neutrophil antigen－2a expression in the Brazilian population［J］．Transfusion，2008;48(Suppl2):179A．

8 Matsuo K，Lin A，Procter J L et al．Variations in the expression of granulocyte antigen NB1［J］．Transfusion，2000;40(6):654－662．

9 Goldschmeding R，van Dalen CM，F(xiàn)aber N etal．Further characterization of the NB1 antigen as a variably expressed 56－62 kD GPI－linked glycoprotein of plasmamembranes and specific granules ofneutrophils［J］．Br JHaematol，1992;81(3):336－345．

10 Clement L T，Lehmeyer JE，Gartland G L．Identification of neutrophil subpopulations with monoclonal antibodies［J］．Blood，1983;61(2):326－332．

11 Wolff J，Brendel C，F(xiàn)ink L et al．Lack of NB1 GP(CD177/HNA－2a)gene transcription in NB1 GP－ neutrophils from NB1 GP－expressing individuals and association of low expression with NB1 gene polymorphisms［J］．Blood，2003;102(2):731－733．

12 Caruccio L，BettinottiM，Matsuo K etal．Expression of human neutrophil antigen－2a (NB1)is increased in pregnancy ［J］．Transfusion，2003;43(3):357－363．

13 Taniguchi K，Nagata H，Katsuki T et al．Significance of human neutrophil antigen－2a(NB1)expression and neutrophil number in pregnancy［J］．Transfusion，2004;44(4):581－585．

14 G?hring K，Wolff J，Doppl W et al．Neutrophil CD177(NB1 gp，HNA－2a)expression is increased in severe bacterial infections and polycythaemia vera［J］．Br JHaematol，2004;126(2):252－254．

15 Passamonti F，Pietra D，Malabarba L et al．Clinical significance of neutrophil CD177 mRNA expression in Ph－negative chronic myeloproliferative disorders［J］．Br JHaematol，2004;126(5):650－656．

16 Anjos S，Nguyen A，Ounissi－Benkalha H et al．A common autoimmunity predisposing signal peptide variantof the cytotoxic T－lymphocyte antigen 4 results in inefficient glycosylation of the susceptibility allele［J］．JBiol Chem，2002;277(48):46478－46486．