艾灸對Hp胃炎大鼠胃組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響①

林亞平 封迎帥 史冬梅 侯艷玲 易受鄉(xiāng) 彭 艷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 經(jīng)穴臟腑相關(guān)重點(diǎn)研究室 針灸生物信息分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410007)

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，艾灸穴位可通過調(diào)節(jié)應(yīng)激性胃黏膜損傷大鼠血清中炎性細(xì)胞因子的含量，減輕胃黏膜損傷［1］，但是艾灸對Hp引起的胃黏膜炎性損傷是否有干預(yù)作用還不明確?本研究采用Hp灌胃建立大鼠Hp胃炎模型，從胃黏膜組織局部炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10 入手探討艾灸對Hp大鼠胃黏膜炎性損傷的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物與主要材料、試劑 健康Sprague-Dawley大鼠，SPF級，雌雄各半，體重180～220 g，共50只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK(湘)2009-2004)。艾炷為蘇州東方艾絨廠生產(chǎn)的“神灸 300灸”艾炷(型號(hào):東方一型)，直徑0．5～0．5 cm，高 0．8 ～0．8 cm。Hp菌株由南華大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供Hp國際標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1(sydney strain 1)菌種，湖南中醫(yī)藥大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) Hp 菌株。大鼠 TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10酶免測定試劑盒購自RD公司。

1．2 動(dòng)物分組 50只大鼠完全隨機(jī)分為5組:A．空白組，B．Hp胃炎模型(模型組)，C．模型+艾灸穴位組(艾灸組)，D．模型+艾灸非穴點(diǎn)組(艾灸對照點(diǎn)組)，E．模型+電針穴位組(電針組)，每組10只。

1．3 動(dòng)物造模及評價(jià)方法 Hp胃炎造模:大鼠禁食12小時(shí)，先以NaHCO3+消炎痛溶液0．5 ml/只灌胃(有益于Hp的定值)，禁食6小時(shí)后再以Hp(含量 109ml－1)1．5 ml/只灌胃，隔天一次，連續(xù) 5 次，灌胃完畢后，禁食禁水4小時(shí)，之后正常喂養(yǎng)。

造模成功指標(biāo)［2］:于最后一次灌胃(艾灸)結(jié)束后的第4周(28天)即實(shí)驗(yàn)的第48天，大鼠禁食12小時(shí)后以10%烏拉坦麻醉固定取材，進(jìn)行造模成功指標(biāo)檢測。尿素酶試驗(yàn)呈陽性(表1)，胃黏膜涂片革蘭氏染色檢查檢測出Hp(圖1)，胃黏膜組織HE染色鏡檢顯示有炎性損傷即胃粘膜上皮細(xì)胞脫落并有炎性細(xì)胞侵潤(圖2)，說明造模成功。

1．4 穴位定位與艾灸、電針方法

1．4．1 穴位定位 動(dòng)物穴位定位參考李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用動(dòng)物穴位定位法及擬人對照法定位［3］。足三里:膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處;中脘:臍與胸骨劍突連線中點(diǎn)，約臍上20 mm;關(guān)元:臍與趾骨聯(lián)合上緣連線上3/5與下2/5交點(diǎn)，約臍下25 mm處;脾俞:第十二胸椎棘突下，旁開5 mm;胃俞:第十三胸椎棘突下，旁開5 mm;足三里的對照點(diǎn):在足陽明經(jīng)和足太陽經(jīng)之間，平足三里;中脘、關(guān)元的對照點(diǎn):分別在平中脘、關(guān)元穴的左側(cè)腰部;脾俞、胃俞的對照點(diǎn):在腋后線和肩胛下角的中線上，分別平胸12、胸13。

1．4．2 艾灸方法 取大鼠雙側(cè)足三里、中脘、關(guān)元、雙側(cè)脾俞和雙側(cè)胃俞穴及這些穴位的對照點(diǎn)。局部剪毛，艾炷黏于穴位或?qū)φ拯c(diǎn)上點(diǎn)燃施灸。單日大鼠仰臥位固定，C組灸足三里、中脘和關(guān)元穴，D組灸足三里、中脘和關(guān)元穴的對照點(diǎn);雙日大鼠俯臥位固定，C組灸脾俞和胃俞，D組灸脾俞和胃俞的對照點(diǎn)。采用蘇州東方艾絨廠提供的“神灸300灸”艾炷進(jìn)行施灸，每個(gè)艾灸部位連續(xù)艾灸5壯，總延時(shí)約20分鐘左右，每日一次，連續(xù)16天。

1．4．3 電針方法 取大鼠雙側(cè)足三里、中脘、關(guān)元、雙側(cè)脾俞和雙側(cè)胃俞穴后穴位局部剪毛、絡(luò)合碘消毒，采用1寸、30號(hào)的華佗牌針灸針分別進(jìn)行針刺，針刺深度約2 mm左右，針刺后連電針，其中兩側(cè)足三里穴接在G6805-2型電針儀的第一組輸出線上，中脘和關(guān)元、兩側(cè)脾俞、兩側(cè)胃俞分別接在電針儀的第二、三、四組輸出線上。單日大鼠仰臥位固定，E組電針足三里、中脘和關(guān)元穴;雙日大鼠俯臥位固定，E組電針脾俞和胃俞。1只大鼠每次共接兩組輸出線，采用疏密波，頻率 4/50 Hz，脈寬 0．5 ms，輸出電壓2～4 V;強(qiáng)度以肢體出現(xiàn)輕微顫抖為度，電針時(shí)間20分鐘，每日一次，連續(xù)16天。

表1 空白組和模型組大鼠胃黏膜組織尿素酶反應(yīng)結(jié)果Tab．1 The result of the gastric mucosa urease reaction of blank group(A)and Hp model group(B)in rats

圖1 空白組(A)和模型組(B)胃黏膜涂片革蘭染色鏡檢結(jié)果Fig．1 The result of the gastric mucosal Gram’s stain smear of blank group(A)and Hp model group(B)

圖2 空白組(A)和模型組(B)胃黏膜組織HE染色鏡檢結(jié)果(×400)Fig．2 The result of the gastric mucosa with HE staining ofblank group(A)and Hp model group(B)(×400)

1．5 實(shí)驗(yàn)步驟 所有動(dòng)物分組后予以濃度為2．5 g/L的阿莫西林生理鹽水溶液0．5 ml/只灌胃，每天2次，連續(xù)3天(為殺滅大鼠上消化道可能定植的Hp);第4天起每天下午13點(diǎn)所有大鼠捆綁于鼠板上，A、B組每日僅捆綁不做治療，C、D組予以艾灸治療，E組予以電針治療，每日一次，連續(xù)16天;同時(shí)，從實(shí)驗(yàn)第11天(即艾灸的第8天)開始灌胃，隔天一次，連續(xù)5次(即9天)，灌胃前所有的大鼠禁食12小時(shí)，上午10點(diǎn)左右 A組分別先予以NaHCO3+消炎痛溶液，生理鹽水0．5 ml/只灌胃，B、C、D、E 組予以 NaHCO3+消炎痛溶液0．5ml/只灌胃;再禁食不禁水6小時(shí)后，在下午16:30開始進(jìn)行第二次灌胃，A組予以生理鹽水1．5 ml/只灌胃，B、C、D、E 組予以 Hp(1×109)1．5 ml/只灌胃，灌胃完畢后，禁食禁水4小時(shí)，之后正常喂養(yǎng);于最后一次灌胃(艾灸)結(jié)束后的第4周(28天)即實(shí)驗(yàn)的第48天，全部大鼠禁食12小時(shí)后以10%烏拉坦(1 ml/100 g)麻醉固定取材。

1．6 標(biāo)本提取及處理 胃組織勻漿液的處理:大鼠麻醉固定后，快速取出全胃，沿胃大彎剪開，用冷生理鹽水沖洗后，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2 500 r/min，離心10分鐘，取上清液，EP管分裝，－20℃保存?zhèn)溆么郎y。

1．7 觀察指標(biāo)

1．7．1 胃黏膜損傷指數(shù)的計(jì)數(shù) 肉眼觀察:用棉簽將胃內(nèi)容物擦拭干凈，觀察胃黏膜是否有充血、水腫及潰瘍。胃黏膜損傷指數(shù)的計(jì)數(shù)［4，5］:參照 GUTH法進(jìn)行，全胃各病灶長度之和為損傷指數(shù)，以mm表示。損傷≤1 mm(包括糜爛點(diǎn))為1分;1 mm＜損傷≤2 mm為2分;2 mm＜損傷≤3 mm為3分;3 mm＜損傷≤4 mm為4分;＞4 mm為5分;損傷寬度＞2 mm者UI加倍。

1．7．2 胃組織勻漿液 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12 含量的測定 大鼠 TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12 測定采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測，按照RD公司試盒的要求進(jìn)行。操作步驟如下:測定前將試劑盒放置室溫40分鐘，所有試劑在使用前都輕輕搖勻。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:取5個(gè)離心管分別標(biāo)記為S2、S3、S4、S5、S6，然后用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液把960 ng/L的標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋成 30、60、120、240、480 ng/L 的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液。加樣:分別設(shè)定空白孔(空白對照孔不加樣本、生物素標(biāo)記的抗-TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12抗體及鏈霉親和素-HRP，其余各步操作相同)、待測樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)孔。待測樣品孔加入離心好的胃組織勻漿液樣本40μl，然后各加入抗-TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-12 抗體 10 μl，鏈酶親和素-HRP 50μl，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，鏈霉親和素-HRP 50μl(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加);加樣時(shí)將樣本加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。蓋上封板膜后，37℃溫育60分鐘。配液:濃縮洗滌液與新鮮的醫(yī)用雙蒸水1∶30倍稀釋，混勻后室溫放置待用。洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干。顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，然后37℃避光反應(yīng)15分鐘。終止:每孔加終止劑50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)黃)。測定:在華東電子DG5033A酶標(biāo)儀上，450 nm處測定OD;計(jì)算:根據(jù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本含量(TNF-α和IL-12的單位是ng/gport，IL-1β和IL-10的單位是pg/mgport)。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用±s表示，多組計(jì)量資料采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett's T3法;非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)±四分位數(shù)間距表示，采用秩和檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)使用SPSS19 for Windows軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2．1 艾灸對Hp胃炎大鼠胃黏膜UI的影響 Hp模型組胃黏膜UI值顯著高于空白組(P＜0.01);艾灸組胃黏膜UI值顯著低于Hp模型組(P＜0.01)和艾灸對照點(diǎn)組(P＜0.01);電針組胃黏膜UI值顯著低于Hp模型組(P＜0.01)和艾灸對照點(diǎn)組(P＜0.05);而艾灸對照點(diǎn)組的胃黏膜UI值與Hp模型組比較無顯著性差異，提示:Hp灌胃造模后，胃黏膜受損;艾灸、電針穴位可降低胃黏膜UI，保護(hù)胃黏膜，但是艾灸穴位降低胃黏膜UI作用與電針比較無明顯差異;艾灸對照點(diǎn)不能降低胃黏膜UI，無保護(hù)胃黏膜的作用(結(jié)果見表2)。

與A組比較，B、D、E組大鼠胃黏膜上皮有明顯充血、水腫及潰瘍;與B、D、E組比較，C組大鼠胃黏膜充血、水腫較輕，無明顯潰瘍，說明艾灸處理能改善胃黏膜炎性損傷(結(jié)果見圖3)。

表2 艾灸對Hp胃炎大鼠胃黏膜UI的影響(中位數(shù)±四分位數(shù)間距，n=10)Tab．2 The effect of the content of the UIof Hp gastritis in rats with moxibustion treatment(median±interquartile range，n=10)

圖3 各組肉眼觀察胃粘膜改變的照片結(jié)果Fig．3 The photograph result of the gastric mucosal change of every groups with eye observing

2．2 艾灸對Hp胃炎大鼠胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β含量的影響 Hp模型組大鼠胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β 含量顯著高于空白組(P＜0．01);艾灸組大鼠胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β含量顯著低于Hp模型組(P＜0．01)、艾灸對照點(diǎn)組(P＜0．05 或 P＜0．01)和電針組(P＜0．05 或 P＜0．01);而艾灸對照點(diǎn)組和電針組胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β含量與Hp模型組比較無顯著性差異，提示艾灸穴位可以使Hp胃炎大鼠胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β含量降低(結(jié)果見表3)。

表3 艾灸對各組大鼠胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β含量的影響 ±s，n=10)Tab．3 The effect of the content of TNF-α，IL-1β gastric tissue homogenate of Hp gastritis in rats with moxibustion treatment ±s，n=10)

表3 艾灸對各組大鼠胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β含量的影響 ±s，n=10)Tab．3 The effect of the content of TNF-α，IL-1β gastric tissue homogenate of Hp gastritis in rats with moxibustion treatment ±s，n=10)

Note:Compared with A group，1)P＜0．01;compared with B group，2)P＜0．01;compared with D group，3)P＜0．05，4)P＜0．01，compared with E group，5)P＜0．05，6)P＜0．01．

Groups TNF-α(ng/gport) IL-1β(pg/mgport)A 21．18±5．61 2．59±0．50 B 22．09±7．152)3)5) 2．62±0．622)4)6)D 29．89±8．52 3．52 ±0．54 E 29．22±7．48 3．57 ±1．01 31．72±9．401) 3．56±0．841)C

表4 艾灸對各組大鼠胃組織勻漿液IL-12，IL-10含量的影響 ±s，n=10)Tab．4 The effect of the content of IL-12，IL-10 gastric tissue hom ogenate of Hp gastritis in rats with m oxibustion treatment ±s，n=10)

表4 艾灸對各組大鼠胃組織勻漿液IL-12，IL-10含量的影響 ±s，n=10)Tab．4 The effect of the content of IL-12，IL-10 gastric tissue hom ogenate of Hp gastritis in rats with m oxibustion treatment ±s，n=10)

Note:Compared with A group，1)P＜0．05，2)P＜0．01;compared with B group，3)P ＜ 0．01;compared with D group，4)P ＜ 0．01，compared with E group，5)P＜0．01．

Groups IL-12(ng/gport) IL-10(pg/mgport)A 22．91±3．70 34．19±4．37 B 21．89±3．783)4)5) 33．99±2．843)4)5)D 27．25±3．21 26．94±4．81 E 28．15±9．02 25．77±6．63 28．67±5．831) 26．62±4．742)C

2．3 艾灸對Hp胃炎大鼠胃組織勻漿液IL-12、IL-10含量的影響 Hp模型組大鼠胃組織勻漿液IL-12含量顯著高于空白組(P＜0.05);艾灸組大鼠胃組織勻漿液IL-12含量顯著低于Hp模型組(P＜0.01)、艾灸對照點(diǎn)組(P＜0.01)和電針組(P＜0.01);而艾灸對照點(diǎn)組和電針組胃組織勻漿液IL-12含量與Hp模型組比較無顯著性差異，提示艾灸穴位可以使Hp胃炎大鼠胃組織勻漿液IL-12含量降低(結(jié)果見表4)。

Hp模型組大鼠胃組織勻漿液IL-10含量顯著低于空白組(P＜0.01);艾灸組大鼠胃組織勻漿液IL-10含量顯著高于Hp模型組(P＜0.01)、艾灸對照點(diǎn)組(P＜0.01)和電針組(P＜0.01);而艾灸對照點(diǎn)組和電針組胃組織勻漿液IL-10含量與Hp模型組比較無顯著性差異，提示艾灸穴位可以使Hp胃炎大鼠胃組織勻漿液IL-10含量升高(結(jié)果見表3)。

3 討論

慢性胃炎是臨床常見病，屬中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”、“痞滿”、“腹脹”、“嘈雜”等范疇，Hp是引起慢性胃炎胃黏膜炎性損傷的主要原因，尤其與慢性胃炎的活動(dòng)性密切相關(guān)［6］。炎癥反應(yīng)是Hp感染后的重要病理生理反應(yīng)，細(xì)菌及其產(chǎn)物促發(fā)了這個(gè)過程，其中最主要的介質(zhì)是細(xì)胞因子。在很多情況下，多種免疫細(xì)胞間的相互作用是通過細(xì)胞因子介導(dǎo)的，炎癥反應(yīng)時(shí)伴有大量炎性細(xì)胞浸潤和各種細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生，TNF-α、IL-8、IL-1、IL-12、IL-10 等細(xì)胞因子可能參與了胃黏膜炎性損傷病理過程，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜炎癥免疫反饋系統(tǒng)［7-9］。TNF-α是一種具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與免疫及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子。TNF-α通過上調(diào)中性粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上黏附分子的表達(dá)引起中性粒細(xì)胞移動(dòng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附和白細(xì)胞穿出血管壁，造成胃黏膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷使胃黏膜血流減少，造成胃黏膜損傷［10］。IL-1在炎癥免疫損傷機(jī)制中起主要的調(diào)節(jié)作用，其作用是通過內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌等途徑實(shí)現(xiàn)的［11］。IL-1有兩種類型:IL-1α 和 IL-1β，以IL-1β為主。在生理?xiàng)l件下，IL-1β具有調(diào)控多種胃上皮細(xì)胞的功能，包括調(diào)節(jié)胃酸分泌的壁細(xì)胞，它被認(rèn)為是目前已知最強(qiáng)的胃酸分泌抑制因子，在胃黏膜損傷發(fā)展發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中起重要作用［12，13］。IL-12是一個(gè)新的特異性細(xì)胞因子，是宿主對細(xì)菌感染反應(yīng)的關(guān)鍵遞質(zhì)，它能促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力，具有免疫刺激作用，可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的天然免疫和Th 細(xì)胞、TCL 細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答［14，15］。IL-10是一種有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，可直接和間接降低抗原特異性T細(xì)胞增殖，主要作為免疫抑制因子發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［1，16］。

艾灸起源于我國，源遠(yuǎn)流長，有2000多年的歷史，是針灸醫(yī)學(xué)的重要組成部分，它具有溫經(jīng)散寒、疏通經(jīng)絡(luò)、扶陽固脫、升陽舉陷和防病保健的作用。其中防病保健作用即指艾灸“治未病”。由于艾灸療法具有良好的溫經(jīng)散寒、疏通經(jīng)絡(luò)、防病保健等作用，因此臨床常用于防治胃脘痛，痞滿等病癥。胃炎病情反復(fù)，纏綿難愈，依據(jù)“治未病”思想指導(dǎo)，對于胃炎的防治，要注意保護(hù)正氣即增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，研究認(rèn)為艾灸就是一種增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的傳統(tǒng)防治方法之一［17］。艾灸增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［17］，扶助正氣的作用是其“治未病”的根本原因，而經(jīng)絡(luò)腧穴的選擇是“治未病”的關(guān)鍵因素，只有選擇了適當(dāng)?shù)碾蜓?，才能充分發(fā)揮灸法的效應(yīng)，達(dá)到防治疾病的目的［17，18］。研究認(rèn)為足三里、關(guān)元是保健強(qiáng)壯和“治未病”要穴［19，20］，足三里、關(guān)元、中脘、胃俞和脾俞等穴位有調(diào)氣導(dǎo)滯、補(bǔ)益脾胃、振奮人體正氣之功效［18，20］，是臨床上治療慢性胃炎的重要腧穴［20-22］，所以本實(shí)驗(yàn)根據(jù)古典醫(yī)籍和臨床經(jīng)驗(yàn)選取特定穴足三里、中脘、胃俞、脾俞和關(guān)元五穴作為艾灸穴點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，與艾灸對照點(diǎn)組比較，艾灸穴位組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低，胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β、IL-12 含量明顯降低，IL-10 含量明顯升高，胃黏膜炎性損傷明顯減輕，由此說明，艾灸足三里、中脘、胃俞、脾俞和關(guān)元穴在干預(yù)胃黏膜炎性損傷過程中有一定的穴位特異性。與電針組比較，艾灸穴位組大鼠胃組織勻漿液TNF-α、IL-1β、IL-12含量明顯降低，IL-10含量明顯升高，胃黏膜炎性損傷明顯減輕，由此說明，艾灸對炎性損傷的干預(yù)作用強(qiáng)于電針，這可能與艾灸的治療未病作用和熱效應(yīng)有關(guān)［23］。總之，Hp感染可改變胃黏膜的微環(huán)境，胃黏膜中的細(xì)胞因子在胃黏膜炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)上起著重要作用，艾灸穴位對Hp引起的胃黏膜炎性損傷有一定的干預(yù)作用，其作用機(jī)理之一可能與艾灸抑制胃黏膜局部組織 TNF-α、IL-1β、IL-12的表達(dá)，促進(jìn)IL-10的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)胃黏膜損傷的作用有關(guān)。

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