胃蛋白酶－胰蛋白酶兩步體外消化法評(píng)定豆粕粉碎粒度

梁 明 楊維仁

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安 271018)

飼料粉碎粒度對(duì)飼料消化利用和動(dòng)物生產(chǎn)性能均有明顯影響，對(duì)飼料的加工過程與產(chǎn)品質(zhì)量也有重要作用［1］。粉碎過程通過破壞谷物種皮的保護(hù)，從而增大了飼料的表面積，增加了飼料與消化酶接觸的機(jī)會(huì)，進(jìn)而提高養(yǎng)分的消化利用率，改善飼料報(bào)酬。適宜的粉碎粒度可顯著提高飼料的轉(zhuǎn)化率，減少動(dòng)物糞便排泄量，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，也利于飼料成分混合均勻，便于顆粒飼料的制作，提高制粒的效率和顆粒質(zhì)量［2］。近年來對(duì)畜禽飼料粉碎粒度的研究，表明了粉碎粒度與制粒和畜禽生產(chǎn)性能的重要關(guān)系，各種畜禽的最適粉碎粒度的評(píng)定是粒度研究的關(guān)鍵［3］。

飼料粒度的測(cè)定方法目前主要有篩上物留存百分率法(兩層篩法)［4］、幾何平均粒度法(十四層篩法)、細(xì)度－均勻度模數(shù)法(七層篩法)［5］。其中十四層篩分法測(cè)定和計(jì)算雖然麻煩，但結(jié)果科學(xué)精確［6］。

飼料粉碎粒度的評(píng)定一般利用動(dòng)物對(duì)飼料原料的消化率狀況衡量。消化率的研究方法主要有體內(nèi)消化法和體外消化法。體內(nèi)法耗資、費(fèi)力、效率低、重演性、可比性差，同時(shí)測(cè)值又受到種種條件限制［7］，體外法相對(duì)簡(jiǎn)單，快速，重復(fù)性好［8］。胃蛋白酶－胰酶兩步體外消化法是目前公認(rèn)的一種較好的測(cè)定蛋白質(zhì)消化率的方法［9］。當(dāng)前對(duì)飼料粉碎粒度的研究主要集中在玉米、小麥和高梁上［10－13］，對(duì)豆粕的研究不是很多。且現(xiàn)在對(duì)粉碎粒度的體外評(píng)定主要為單一原料粉碎粒度的研究，未發(fā)現(xiàn)對(duì)不同粉碎粒度原料制成配合飼料的體外研究。本試驗(yàn)通過胃蛋白酶－胰蛋白酶兩步消化法測(cè)定不同粒度豆粕及不同粒度基礎(chǔ)配制的粉狀配合飼料、顆粒料的干物質(zhì)和蛋白質(zhì)的消化率，研究豆粕的最適粉碎粒度，探討豆粕粉碎粒度與豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)儀器

SFP－ZY多腔高效多功能粉碎機(jī):唐山雙義飼料機(jī)械;粉碎篩片(直徑 1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm、2.5 mm、3.0 mm);SZLH420 －150 制粒機(jī):江蘇溧陽正申機(jī)械;標(biāo)準(zhǔn)篩一套(直徑200 mm);頂擊式振篩機(jī):浙江上虞五金紗織篩廠;恒溫水浴振蕩器、真空泵、布氏漏斗等。

1.2 商品酶

胃蛋白酶(活性1∶3000):北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司;胰蛋白酶(活性2 500 u/mg):阿拉丁化學(xué)有限公司;緩沖液:pH 1.4，0.05 mol/L，HCl－KCl緩沖液;pH 6.8，0.05 mol/L，KH2PO4－ NaOH 緩沖液。

1.3 試驗(yàn)待測(cè)樣品

豆粕:水分(12 ±0.1)%，直徑為 1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mm篩孔孔徑的篩片粉碎獲得。

粉狀配合飼料、顆粒料:按照配方(表1)配料、混合，用壓縮比1∶10、環(huán)?？讖?.2 mm的環(huán)模加工制粒。

表1 試驗(yàn)日糧配方組成

1.4 方法與測(cè)定

1.4.1 基礎(chǔ)指標(biāo)的測(cè)定

水分按GB/T 6435—2006進(jìn)行。粒度按照GB 6971—1986《飼料粉碎機(jī)試驗(yàn)方法》進(jìn)行。蛋白質(zhì)、干物質(zhì)以半微量凱氏定氮法及105℃烘干法測(cè)定飼料原料及消化處理后的飼料樣品的含氮量及干物質(zhì)含量。

1.4.2 胃蛋白酶和胰蛋白酶最適濃度的確定［14－16］

1.4.2.1 胃蛋白酶最適酶量的選擇

準(zhǔn)確稱取5份0.5 g豆粕(過40目)于250 mL培養(yǎng)三角瓶中，加入 pH 1.4 的0.05 mol/L HCl－ KCl緩沖液30 mL。每個(gè)三角瓶加入含不同胃蛋白酶活性單位(10、30、50、70、90 mg/mL 的 HCl－ KCl緩沖液配置)的溶液各1 mL，再加入0.5 mL細(xì)菌生長(zhǎng)抑制劑(0.5%的氯霉素)，蓋上橡膠塞，將三角瓶置于(37±0.1)℃臺(tái)式恒溫?fù)u床(恒溫水浴振蕩器)中，以其溫度達(dá)到37℃開始計(jì)時(shí)，振蕩(80次/min)3 h。

使用真空泵和布氏漏斗進(jìn)行抽濾(過濾前，濾紙須稱重，鉛筆標(biāo)號(hào))，多次沖洗殘留物，殘?jiān)幚?(1)消化結(jié)束后，在三角瓶中加入5 mL 20%的磺基水楊酸溶液.室溫放置30 min沉淀蛋白質(zhì);(2)過濾，將三角瓶殘留物用1%磺基水楊酸溶液完全沖洗到漏斗中;(3)用10 mL酒精和10 mL丙酮分別沖洗殘?jiān)?次。小心取下濾紙及殘?jiān)?，折疊放置培養(yǎng)皿中，65℃烘干，移入稱量瓶并稱重。將殘?jiān)盀V紙105℃烘干，測(cè)定干物質(zhì)。殘?jiān)盀V紙用凱氏定氮法，測(cè)定殘留物的蛋白質(zhì)含量。

計(jì)算干物質(zhì)和蛋白質(zhì)消化率，確定0.05 mol/L HCl－KCl緩沖液中胃蛋白酶的最適用量。

1.4.2.2 胰蛋白酶最適酶量的選擇

準(zhǔn)確稱取5份0.5 g豆粕于250 mL培養(yǎng)三角瓶中，用得到的最適胃蛋白酶濃度的0.05 mol/L的HCl－KCl緩沖液溶液作前處理。以放入順序取下三角瓶，用0.1 mol/L NaOH 溶液和0.1 mol/L的 HCl滴定消化液，使其 pH 6.8，量取 10 mL KH2PO4－NaOH緩沖液于三角瓶中，然后加入含不同胰蛋白酶活性條件(4、8、12、16、20 mg/mL 的 KH2PO4－ NaOH緩沖液配置)溶液各1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

按1.4.2.1的方法測(cè)定胃蛋白－胰蛋白酶兩步法得到殘?jiān)母晌镔|(zhì)和蛋白質(zhì)的含量。

計(jì)算干物質(zhì)和蛋白質(zhì)消化率，確定0.05 mol/L KH2PO4－NaOH緩沖液中胰蛋白酶的最適用量。

1.4.3 胃蛋白酶 － 胰蛋白酶兩步法測(cè)定過程［17－20］

分別取5種粒度的豆粕及不同粒度豆粕配制的粉狀配合飼料、顆粒料0.5 g于250 mL的培養(yǎng)三角瓶中，每種樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，并作空白試驗(yàn)。使用最適濃度的胃蛋白酶和胰蛋白酶，參照1.4.1的方法測(cè)定不同樣品的干物質(zhì)和蛋白質(zhì)含量，按下列公式計(jì)算干物質(zhì)和蛋白質(zhì)的消化率。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SAS 9.0軟件進(jìn)行分析，采用Duncan法多重比較，P ＜0.05者為差異顯著。采用Orign8.0軟件進(jìn)行線性擬合并進(jìn)行相關(guān)性分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料原料與粒度

生產(chǎn)上對(duì)于粉碎的程度一般用飼料粒度表示。飼料粉碎粒度就是指飼料或原料樣品的平均顆粒大?。?1］。選用 1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mm 篩孔孔徑的篩片粉碎得到的原料及粉狀配合飼料樣品的粒度如表2所示。由表2可以看出:隨著篩孔孔徑從1.0 mm擴(kuò)大到3.0 mm，豆粕粉碎樣品的質(zhì)量幾何平均粒徑增大(P＜0.05);粉狀配合飼料的質(zhì)量幾何平均粒度隨豆粕粒度的變化未表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律:篩孔孔徑超過2.5 mm，粉狀配合飼料的粒度明顯增大。篩孔孔徑從1.0～2.0 mm，粒度變化不大(P ＞0.05)。

表2 粒度測(cè)定

王衛(wèi)國等［22］對(duì)玉米和豆粕進(jìn)行粉碎試驗(yàn)，結(jié)果顯示粉碎篩片的篩孔孔徑與同一種原料的粉碎物的質(zhì)量幾何平均粒徑隨篩孔減小而減小，且呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。本試驗(yàn)再次驗(yàn)證了篩孔孔徑與粒度間的線性關(guān)系(P＜0.01)，但是篩孔孔徑與粉狀配合飼料粒度之間不存在規(guī)律性，出現(xiàn)這種情況原因可能與飼料中豆粕添加比例小有關(guān)。

2.2 胃蛋白酶、胰蛋白酶最適濃度

豆粕養(yǎng)分消化率與胃蛋白酶濃度、胰蛋白酶濃度關(guān)系見圖1、圖2。由圖1、圖2可以得出:胃蛋白酶最適濃度是70 mg/mL，胰蛋白酶最適濃度是16 mg/mL。

2.3 粒度與豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率

2.3.1 粒度對(duì)豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率的影響

對(duì)飼料粉碎的目的是增加飼料表面積，使胃腸內(nèi)的消化酶與飼料充分接觸，提高動(dòng)物對(duì)飼料的消化率，提高飼料報(bào)酬。體外模擬消化方法除了受消化酶組成、劑量、pH和消化時(shí)間等影響外，還受飼料粒度的影響［23］。飼料原料粉碎粒度不同，直接影響其與消化酶的接觸面積，進(jìn)而影響消化率。對(duì)于顆粒飼料，原料粒度的不同會(huì)影響飼料的調(diào)質(zhì)效果，影響顆粒飼料的質(zhì)量，進(jìn)一步影響消化率。王衛(wèi)國［17］曾對(duì)5種不同粒度12/20目，40/60目，60/80目，80/100目(12/20目表示飼料通過12目篩，留存20目篩)的玉米、麩皮、豆粕、棉粕、菜粕分別進(jìn)行體外消化試驗(yàn)研究，結(jié)果表明隨粉碎粒度的增加消化率均有降低的趨勢(shì)，但豆粕的變化幅度較小。第二年，其用小型錘片粉碎機(jī)在(4.5、2.5、2.0、1.0、0.6 mm)的篩片下進(jìn)行粉碎，并利用胃蛋白酶－胰蛋白酶兩步體外消化法測(cè)定不同粉碎物的蛋白質(zhì)體外消化率得到同樣的結(jié)果［22］。

本試驗(yàn)選用濃度為70 mg/mL的胃蛋白酶，16 mg/mL的胰蛋白酶分別測(cè)出不同粒度(432、505、637、717、805 μm)的豆粕，及以不同粒度基礎(chǔ)加工的粉狀配合飼料及顆粒料的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)體外消化率。測(cè)定結(jié)果如表3。

表3 豆粕粒度與體外消化率

從表3中可同樣得出豆粕體外DM、CP消化率隨豆粕粉碎粒度的增加均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但637、717、805 μm組間豆粕及顆粒料體外DM消化率差異不顯著(P ＞0.05)。豆粕粒度從 432 μm 到 505 μm和從637 μm到717 μm對(duì)豆粕體外CP消化率影響均不顯著(P ＞0.05)，這與李清曉等［24］的研究結(jié)果不一致，可能與選擇的粒度范圍和粉碎機(jī)粉碎方式不同有關(guān);隨豆粕粒度的增加，粉狀配合飼料的體外DM、CP消化率未呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，但637 μm組DM、CP體外消化率最高;對(duì)于顆粒飼料，豆粕粒度的變化對(duì)DM體外消化率影響不明顯(P＞0.05)，但對(duì)顆粒料CP體外消化率影響明顯(P＜0.05)，隨粒度增加線性降低(P＜0.01)。比較粉狀配合飼料和顆粒料的DM、CP消化率，很容易發(fā)現(xiàn)顆粒料的制作對(duì)于提高飼料消化率有明顯的效果。

2.3.2 粒度與豆粕、粉狀配合飼料及顆粒料消化率的線性分析

表4 豆粕粒度(X)與體外消化率(Y)的關(guān)系

對(duì)不同粉碎粒度的豆粕及配制的粉狀配合飼料、顆粒料的體外消化率進(jìn)行線性回歸分析見表4。從表4中可以看出:本試驗(yàn)豆粕和顆粒料的體外消化率隨豆粕粉碎粒度的變化呈直線相關(guān)關(guān)系，即隨粒度的減小豆粕及顆粒料的消化率呈線性提高(圖2)，但對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)和飼喂而言，并非粒度越細(xì)越好。適當(dāng)?shù)姆鬯榱６壤谠铣煞只旌暇鶆颍阌陬w粒飼料的制作，提高制粒的效率和顆粒質(zhì)量。但粒度過小會(huì)降低粉碎生產(chǎn)效率，且易造成物料流動(dòng)不暢，甚至形成結(jié)拱，影響正常生產(chǎn)。對(duì)于仔雞而言，粒度降低可通過增加與消化酶接觸的表面積，改善營養(yǎng)素的消化率，但也有人認(rèn)為粗顆粒會(huì)降低食糜通過肌胃的速率［25］，增加與消化酶的接觸時(shí)間，從而改善能量利用率和營養(yǎng)素的消化率［26］，并且粒度過細(xì)蛋白質(zhì)消化率提高不明顯，反而可能會(huì)加重動(dòng)物胃腸的角質(zhì)化和損害。對(duì)直線相關(guān)關(guān)系進(jìn)行顯著性差異分析后，豆粕及顆粒料的消化率與粉碎粒度的關(guān)系為顯著性直線正相關(guān)(P＜0.01)。不同粉碎粒度的豆粕配制的粉狀配合飼料進(jìn)行體外模擬消化，DM、CP消化率隨豆粕粉碎粒度的變化未出現(xiàn)明顯的線性規(guī)律(P=0.443、P=0.113)。這可能與豆粕在粉狀配合飼料中添加比例小有關(guān)。

圖3 粒度與消化率的關(guān)系

3 結(jié)論

隨篩孔孔徑的增大豆粕的粉碎粒度增大，并呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系(P＜0.01)。豆粕粒度的變化對(duì)豆粕及顆粒料的體外消化率影響明顯，綜合考慮505 μm組和637 μm組均可得到較高的消化率，但考慮到粒度越小在粉碎過程耗費(fèi)成本越大，認(rèn)為637 mm為豆粕制作仔雞顆粒料最適粉碎粒度，即2.0 mm為制作仔雞顆粒料的篩片最佳篩孔孔徑。

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