PSA值增高患者前列腺按摩后尿液中DD3 mRNA檢測(cè)及臨床意義

陳 鑫* 李宇峰王 萍楊 卓高福金臧偉清劉艷玫岳柏華

（1 吉林市中心醫(yī)院泌尿外科，吉林 吉林 132000 ；2 吉林市兒童醫(yī)院，吉林 吉林 132000）

PSA值增高患者前列腺按摩后尿液中DD3 mRNA檢測(cè)及臨床意義

陳 鑫1* 李宇峰1王 萍2楊 卓1高福金1臧偉清1劉艷玫1岳柏華1

（1 吉林市中心醫(yī)院泌尿外科，吉林 吉林 132000 ；2 吉林市兒童醫(yī)院，吉林 吉林 132000）

目的 探討PSA值增高患者前列腺按摩后尿液沉渣中DD3 mRNA的表達(dá)，并討論其臨床意義。方法 收集26例前列腺癌患者、50例前列腺增生癥（BPH）患者前列腺按摩后尿液，離心取細(xì)胞沉淀物，提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）瓊脂糖電泳法方法檢測(cè)其中DD3mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 前列腺癌患者前列腺按摩后尿液中DD3 mRNA陽性率明顯高于前列腺增生患者，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同Gleason分級(jí)研究組的前列腺癌患者DD3 mRNA表達(dá)陽性率無明顯差別。結(jié)論 患者PSA升高時(shí)，前列腺按摩后尿液中DD3mRNA檢測(cè)是診斷前列腺癌的一種有效的方法，具有無侵入性，較前列腺穿刺活檢的損傷更小。

DD3 mRNA；前列腺癌；前列腺液；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

前列腺特異性抗原（PSA）檢測(cè)可以早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌，但PSA只具有前列腺組織特異性, 而無腫瘤特異性。因此，其檢測(cè)假陽性率和假陰性率均較高。二氫二醇脫氫酶3，DD3（differential display code 3）基因是一種前列腺癌特異性基因，僅表達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞，并且高度表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞以及轉(zhuǎn)移灶、壞死灶中，僅少量表達(dá)于正常前列腺、良性前列腺增生細(xì)胞中，在其他腫瘤細(xì)胞中無表達(dá)[1]。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

前列腺癌及前列腺增生患者均選吉林市中心醫(yī)院的門診患者以及住院患者。

研究組：收集的26例前列腺癌患者入研究組，年齡54～78歲（平均68.4歲），依據(jù)Gleason分級(jí)分為：高分化癌組11例，年齡60～78歲，平均年齡（68.54±5.18）歲，中分化組9例，年齡54～75歲，平均年齡（67.50±7.08）歲，低分化組6例，年齡60～78歲，平均年齡（67±6.51）歲。對(duì)照組：共50例，為前列腺增生患者，年齡52～80歲，平均（68.25±6.25）歲。診斷、分型標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本的收集及檢驗(yàn)采用雙盲法。將前列腺穿刺活檢病理診斷或術(shù)后病理（包括經(jīng)尿道電切術(shù)后病理）診斷結(jié)果作為病例的診斷。

1.2 標(biāo)本的采集

在活檢穿刺前局部麻醉下和術(shù)前硬膜外麻醉下，經(jīng)直腸按摩前列腺，收集患者的前列腺按摩后前段尿液20～30mL，并記錄患者年齡、B超所測(cè)量患者前列腺體積、血清tPSA的值、病理報(bào)告結(jié)果，在低溫下稍作保存后4℃、3000rmp的條件下離心10min，將沉淀物加等量4℃PBS洗滌兩次，4℃、3000rmp的條件下離心10min，所得標(biāo)本置于DEPC處理的eppendorf管中，放于-80℃保存。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄

1.5 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

合成特異性DD3引物：上游引物5'GCTACTCAGGACCAGTTGT TAAG3'；下游引物5'GATACATCATTGGCAGCTCATAG3'；擴(kuò)增產(chǎn)物151bp。人actin引物：上游引物5'CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG 3'；下游引物5'GGAGCAATGATCTTGATCTTC 3'；擴(kuò)增產(chǎn)物175bp。PCR 反應(yīng)體系經(jīng)過94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像，系統(tǒng)觀察175bp的內(nèi)參產(chǎn)物或151bp的目的產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析?？ǚ綑z驗(yàn)分析研究組和對(duì)照組的DD3mRNA陽性率、研究組DD3mRNA陽性率在不同病理分級(jí)之間有無明顯差異。

2 結(jié) 果

2.1 臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)

見表1。

表1 研究組與對(duì)照組相關(guān)指標(biāo)描述（）

表1 研究組與對(duì)照組相關(guān)指標(biāo)描述（）

指標(biāo)BPHPCaP值年齡68.25±6.2568.42±6.870.419 tPSA（ng/mL）6.27±8.2320.48±23.060.002

由表1可知，兩組患者的年齡比較無顯著差異；tPSA的比較都有顯著性差異，前列腺癌患者tPSA明顯高于前列腺增生患者。

2.2 前列腺液涂片

（39）惡辱得豈不敬信乎，報(bào)應(yīng)甚速。（《太上說玄天大聖真武本傳神呪妙經(jīng)註》卷六，《中華道藏》30/578）

我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，PSA值增高患者前列腺液中細(xì)胞學(xué)檢查，前列腺癌患者前列腺液中存在大量腫瘤細(xì)胞，而前列腺增生患者前列腺液中未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，瑞氏染色（×400）。見圖1、圖2。

圖1 前列腺癌患者前列腺液中的癌細(xì)胞

圖2 前列腺增生患者前列腺液未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞

2.3 RT-PCR 檢測(cè)DD3mRNA的結(jié)果

見圖3。

圖3 DD3 mRNA RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

前列腺癌組與前列腺增生癥組患者DD3mRNA陽性率有顯著性差異，見表2。

表2 前列腺癌組與前列腺增生癥組患者DD3mRNA陽性率比較

由表2可知，兩組患者尿中DD3mRNA陽性率有顯著性差異，前列腺癌患者DD3mRNA陽性率明顯高于前列腺增生患者。

2.4 各個(gè)Gleason 評(píng)分/分化程度中DD3 mRNA陽性率比較

見表3。各個(gè)Gleason 評(píng)分/分化程度中DD3 mRNA陽性率無明顯差異。

表3 不同Gleason 評(píng)分/分化程度組DD3 mRNA陽性率比較

3 討 論

PSA是臨床上廣泛認(rèn)可的診斷前列腺癌敏感指標(biāo)。然而PSA具有前列腺組織特異性，并不是對(duì)前列腺癌組織的特異性，不是所有前列腺癌患者血清PSA均升高，而且血清PSA升高并不能診斷為前列腺癌，如前列腺炎、良性前列腺增生等疾病以及直腸指診等前列腺檢查亦可引起PSA升高，當(dāng)血清tPSA位于4-10ng/mL時(shí)，無法鑒別前列腺增生和前列腺癌，即所謂“灰區(qū)”[2]，此時(shí)需要通過前列腺穿刺活檢，但前列腺穿刺活檢是有創(chuàng)檢查，給患者帶來一定痛苦以及感染、出血等并發(fā)癥。二氫二醇脫氫酶3，DD3（differential display code 3）是近年來發(fā)現(xiàn)的位于人染色體9q21～22，全長(zhǎng)約25kb的基因，在人類前列腺癌細(xì)胞中高度表達(dá)，在非癌變的前列腺組織中低表達(dá)甚至無表達(dá)，在其他組織、器官中均無表達(dá)，是一個(gè)正逐步被臨床認(rèn)可的具有臨床潛力的前列腺癌標(biāo)志物[3]。RT-PCR是目前常用的檢測(cè)RNA的成熟技術(shù)，因其具有高敏感性、高特異性等，能幫助我們檢測(cè)出樣本中微量甚至痕量RNA的表達(dá)[4]。

本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者與前列腺增生患者DD3mRNA的表達(dá)陽性率差異明顯（P＜0.01），證明在前列腺良性增生、前列腺癌等疾病鑒別診斷中，DD3mRNA表達(dá)陽性率有一定的價(jià)值。

本研究中，3例前列腺增生患者DD3mRNA陽性，2例診斷來自為前列腺穿刺活檢的病理結(jié)果，1例來自經(jīng)尿道電切術(shù)后病理，由于前列腺穿刺活檢及電切術(shù)后病理均有一定的假陰性，其結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

Gleason分級(jí)與前列腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后關(guān)聯(lián)性良好，逐漸得到泌尿外科界的認(rèn)可[5]，是目前前列腺癌制定治療方案、評(píng)價(jià)預(yù)后參考的重要指標(biāo)之一。但目前DD3mRNA表達(dá)量與Gleason分級(jí)關(guān)系尚未定論，Bussemakers[6]等研究顯示DD3 mRNA的表達(dá)與Gleason評(píng)分有明顯相關(guān)性，而klecka[7]等報(bào)道DD3 mRNA的表達(dá)與Gleason分級(jí)無關(guān)，與腫瘤是否進(jìn)展及轉(zhuǎn)移也沒有明顯相關(guān)性，本研究未見DD3mRNA的表達(dá)與Gleason分級(jí)的明顯相關(guān)性，可能與樣本數(shù)量少有關(guān)，尚需更大的樣本量，進(jìn)一步研究，以了解二者的關(guān)系。

綜上所述，前列腺按摩后尿液中DD3mRNA的檢測(cè)作為一種無創(chuàng)性診斷方法，具有操作簡(jiǎn)單、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，值得臨床廣泛推廣應(yīng)用。

[1] De-Kok JB,Verhaegh GW,Roelofs RW,et al.DD3(PCA3),a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors[J].Cancer Res ,2002,62(9):2695-2698.

[2] 賀大林,張林琳.前列腺癌的診斷和治療[J].臨床外科雜志,2008, 16(2): 91-93.

[3] GandiniO,SantulliM,CardilloMR,et al.DD3,A very sensitive and specific marker to detect prostate tumors [J].Cancer Res,2003,63( 15):4747-4749.

[4] J.薩姆布魯克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯著;金冬雁,黎孟楓譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1998:55-56.

[5] 孫穎浩.我國(guó)前列腺癌的研究現(xiàn)狀[J]. 中華泌尿外科雜志,2004, 25(2):77-80.

[6] Bussemarkers MJ,van Bokhoven A,Verhaegh GW,et al. DD3: a new prostate specific gene,highly over expressed in prostate cancer[J].Cancer Res,1999,59(23):5975-5979.

[7] Kleck A,Holubec L.Differential display code 3 (DD3/PCA3) in prostate cancer diagnosis [J].Anticancer Res,2010,30(2):665-670.

Detection of DD3 mRNA in Urine Sediments Obtained after Prostatic Massage of Patients with High PSA Value and its Clinical Significance

CHEN Xin1*, LI Yu-feng1, WANG Ping2, YANG Zhuo1, GAO Fu-jin1, ZANG Wei-qing1, LIU Yan-mei1, YUE Bai-hua1
(1 Department of Urology, Jilin Central Hospital, Jilin 132000, China; 2 Jilin Children's Hospital, Jilin 132000, China)

Objective To study the expressions of differential display code 3 mRNA (DD3 mRNA) in urine sediments samples of patients with high PSA value and its diagnostic value. Methods The samples were collected from 50 benign prostatic hyperplasia and 26 prostate cancer patients before biopsy or operation, the total RNA had been extracted for RT-Polymerase chain reaction, agarose gel electrophoresis were applied to confirm PCR product. Results There was significant difference of DD3 mRNA positive rate in urine sediments obtained after prostatic massage between BPH and PCa patients (P＜0.01). DD3mRNA positive rate has no significant difference between Gleason grade.Conclusion Detection of DD3mRNA in urine sediments obtained after prostatic massage has excellent diagnose efficacy for prostate cancer as a promising and independent non-invasive method.

DD3 mRNA; Prostate cancer; Prostatic fluid; Reverse transcrip tase polymerase chain reaction

R737.25

B

1671-8194（2013）01-0031-03

*通訊作者：E-mail： sanfeng8422@yahoo．com．cn