五步蛇毒抗凝血作用機(jī)制的研究

余 雷，何華晉，唐榕英，寧 宗

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021;2柳州市工人醫(yī)院;3廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院)

五步蛇又稱尖吻蝮，在我國主要分布在長江流域及其以南地區(qū)，山區(qū)較為多見［1］。五步蛇傷病例在臨床上很常見，因其咬傷與彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)有類似的臨床表現(xiàn)，多年來一直被認(rèn)為是引起DIC的病因之一［2］。近年來，Isbisterd等指出五步蛇咬傷引起的臨床表現(xiàn)是蛇毒誘導(dǎo)的消耗性凝血障礙(Venom-induced consumption coagulopathy，VICC)［3，4］。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠五步蛇毒中毒模型，檢測大鼠凝血功能、凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)活性及部分血常規(guī)指標(biāo)，并于光鏡下觀察了肺臟微循環(huán)改變，旨在探討五步蛇咬傷所致凝血功能障礙的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物及試劑 健康清潔級(jí) Sprague-Dawley(SD)大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量180～200 g(合格證:SCXK桂2010-2011)，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;五步蛇毒白色凍干粉(批號(hào)100228)，江西鷹潭蛇場廣州辦事處提供。

1．2 動(dòng)物分組及模型制作 參考黃松等［4］文獻(xiàn)，將五步蛇毒白色凍干粉與0．9%氯化鈉注射液按5∶1(每5 mg五步蛇毒溶于1 mL生理鹽水中)配成蛇毒溶液。將30只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各15只，分別予0．35 mL蛇毒溶液及等量生理鹽水腹腔內(nèi)注射，其后均常規(guī)喂養(yǎng)。

1．3 觀察指標(biāo)及標(biāo)本采集 腹腔注射藥物24 h內(nèi)觀察大鼠的行為表現(xiàn)，包括精神狀態(tài)、活動(dòng)、進(jìn)食、呼吸頻率、對(duì)刺激的反應(yīng)等。24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg/kg)，麻醉成功后立即沿腹正中線切開暴露腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血4．0 mL(其中2．0 mL注入EDTA抗凝管，余2．0 mL注入枸櫞酸鈉抗凝管)，立即送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科檢查凝血功能指標(biāo)PT、纖維蛋白原(Fg)、凝血因子(Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ)活性及血常規(guī)指標(biāo) WBC、RBC、Hb、PLT;迅速切開胸腔，觀察胸腹腔各臟器的形態(tài)學(xué)變化;剪取大鼠右上肺葉，放入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋固定后切片，HE染色后送廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，光鏡下觀察肺臟微血管內(nèi)有無微血栓形成。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組行為表現(xiàn)及解剖發(fā)現(xiàn) ①行為表現(xiàn):腹腔注射藥物30 min后兩組均未出現(xiàn)死亡，實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)不同程度的懶動(dòng)、嗜睡、呼吸深快、反應(yīng)遲鈍、步態(tài)不穩(wěn)、拖步等表現(xiàn)，對(duì)照組無明顯異常。②解剖發(fā)現(xiàn):24 h后實(shí)驗(yàn)組腹腔注射部位周圍皮下均可見大小不等的瘀斑，未見局部組織壞死，腹腔內(nèi)有較多不凝血液，胃、腸及腸系膜表面可見散在出血點(diǎn)，胸腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)積血;對(duì)照組無明顯異常。

2．2 兩組血常規(guī)指標(biāo)及凝血功能指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，24 h后實(shí)驗(yàn)組PLT計(jì)數(shù)明顯減少(P＜0．05)、WBC 計(jì)數(shù)明顯增高(P ＜0．05)，RBC 計(jì)數(shù)及Hb均無明顯變化(P均＞0．05)，詳見表1;實(shí)驗(yàn)組血清Fg明顯下降(P＜0．05)，PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性無明顯變化(P均＞0．05)，詳見表2。

2．3 兩組肺臟組織光鏡下表現(xiàn) 對(duì)照組肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁內(nèi)毛細(xì)血管、小血管清晰可辨，毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞多為1～2個(gè)，未見微血栓，肺泡腔未見滲出(見圖1，A、B圖均為200×)。實(shí)驗(yàn)組肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁內(nèi)毛細(xì)血管、小血管清晰可辨，肺泡間隔稍增厚，少數(shù)毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞超過2個(gè)，部分肺泡上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，未見微血栓，肺泡腔亦未見滲出(見圖2，C圖為100×，D圖為400×)。

表1 兩組 RBC、Hb、PLT 比較(n=15±s)

表1 兩組 RBC、Hb、PLT 比較(n=15±s)

組別 RBC(×109/L) Hb(g/L) WBC(×109/L)PLT(×109/L)實(shí)驗(yàn)組 6．31 ±0．25 138．40 ±4．86 10．22 ±0．81 14．48 ± 7．99對(duì)照組 6．44 ±0．37 139．00 ±3．39 6．13 ±1．08 938．20 ±188．99

表2 兩組PT、Fg及凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性比較(n=15 ± s)

表2 兩組PT、Fg及凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性比較(n=15 ± s)

組別 PT(s)Fg(g/L)凝血因子Ⅷ(%)凝血因子Ⅸ(%)凝血因子Ⅺ(%)實(shí)驗(yàn)組 9．40 ±0．46 0．64 ±0．19 231．56 ±3．24 40．24 ±1．76 50．80 ±2．59對(duì)照組 9．40 ±0．46 2．63 ±0．11 231．04 ±5．25 40．88 ±4．33 50．49 ±3．09

圖1 對(duì)照組大鼠光鏡下肺臟組織表現(xiàn)

圖2 實(shí)驗(yàn)組大鼠光鏡下肺臟組織表現(xiàn)

3 討論

五步蛇咬傷病例臨床上很常見，國內(nèi)外近年來有報(bào)道指出，蛇咬傷并非一定引起DIC，而可能是“非典型DIC”或者“VICC”。關(guān)于蛇咬傷患者合并微血管病變而非出現(xiàn)急性DIC的報(bào)道，可能是因?yàn)椴糠执祟惢颊叩陌Y狀能在治療數(shù)周后緩解而無明顯后遺癥［7］，與急性DIC的惡性進(jìn)展不一致。由于臨床診斷的局限性，上述結(jié)論多半是通過臨床表現(xiàn)與臨床實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果推測得出，并未有微循環(huán)的病理學(xué)依據(jù)。本研究顯示，腹腔注射藥物30 min后兩組均未出現(xiàn)死亡，實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)不同程度的懶動(dòng)、嗜睡、呼吸深快、反應(yīng)遲鈍、步態(tài)不穩(wěn)、拖步等表現(xiàn);注藥24 h后實(shí)驗(yàn)組腹腔注射部位周圍皮下均可見大小不等的瘀斑，未見局部組織壞死，腹腔內(nèi)有較多不凝血液，胃、腸及腸系膜表面可見散在出血點(diǎn)，胸腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)積血。提示實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)一定中毒癥狀，且有急性出血表現(xiàn)。但本研究中肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁內(nèi)毛細(xì)血管、小血管清晰可辨，肺泡間隔稍增厚，少數(shù)毛細(xì)血管內(nèi)紅細(xì)胞超過2個(gè)，部分肺泡上皮及血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，未見微血栓，肺泡腔亦未見滲出。初步推測五步蛇毒并未導(dǎo)致大鼠的微循環(huán)功能障礙，其通過內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)引起大鼠發(fā)生DIC的可能性不大?？赡苤皇且环N消耗性凝血功能障礙，即VICC狀態(tài)。當(dāng)然，該實(shí)驗(yàn)不能排除染毒大鼠肺臟內(nèi)曾有微血栓形成但被繼發(fā)亢進(jìn)的纖溶系統(tǒng)清除或其他終末器官內(nèi)有微血栓形成的可能;另一種可能是和模型建立使用的中毒劑量有關(guān)。臨床上亦有用五步蛇毒類凝血酶來抗血栓［8］，在治療量或者過量情況下也引起凝血功能障礙，但未見有發(fā)生DIC的報(bào)道，此與本研究結(jié)論一致。

本研究還顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組PLT計(jì)數(shù)明顯減少、WBC計(jì)數(shù)明顯增高，RBC計(jì)數(shù)及Hb均無明顯變化;實(shí)驗(yàn)組血清Fg明顯下降，PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ活性無明顯變化。提示:①蛇毒可能直接消耗體內(nèi)的PLT，阻止血小板性血栓形成;蛇毒中的類凝血酶成分能直接作用于Fg，裂解其血纖肽A，產(chǎn)生不交聯(lián)蛋白，此蛋白很快可被機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬和被循環(huán)血液清除;此外，蛇毒中的纖溶成分能直接溶解纖維蛋白，進(jìn)一步導(dǎo)致Fg消耗。②實(shí)驗(yàn)組WBC增高可能與中毒、機(jī)體出血引起的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān);RBC、Hb未見明顯下降，而大鼠腹腔內(nèi)及多個(gè)臟器均發(fā)現(xiàn)有出血的原因，可能是五步蛇毒引起的損傷屬于急性出血(未直接引起溶血和廣泛性紅細(xì)胞性血栓形成)及急性中毒反應(yīng)所致血液濃縮。PT和凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ無明顯變化的原因考慮可能是染毒24 h內(nèi)經(jīng)歷了凝血因子消耗、再恢復(fù)的過程;五步蛇毒或許對(duì)凝血因子無明顯影響。

綜上所述，五步蛇毒所致機(jī)體以出血為主的特征性改變屬于機(jī)體消耗性凝血功能障礙。

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