SSc-PF小鼠肺組織和外周血中Th2細(xì)胞水平、IL-10表達(dá)變化及意義

李 宇，張建全，鐘小寧，雷 玲，謝佳峻

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

系統(tǒng)性硬化病(SSc)是一種病因不明，以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征，可影響內(nèi)臟包括心、肺和消化道器官的全身性疾病。其49．4%～90.0%的患者會(huì)出現(xiàn)肺纖維化(PF)，在各種結(jié)締組織中發(fā)生率最高，也是病死率增加的一個(gè)重要原因［1］。目前，對(duì)SSc-PF起始和持續(xù)的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，尚無(wú)有效措施預(yù)防或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)程。Th2細(xì)胞是重要的促纖維化細(xì)胞，以分泌IL-4、IL-10為特征，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、增生，最終導(dǎo)致特發(fā)性PF形成［2］。2012年 5～12月，我們觀察了SSc-PF小鼠肺組織及外周血Th2細(xì)胞水平和IL-10表達(dá)變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1．1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性 BALB/c小鼠30只，SPF級(jí)，6周齡，體質(zhì)量20 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，正常飼養(yǎng)。藥品與試劑:注射用鹽酸博萊霉素(BLM，日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，批號(hào)491240，15 mg/支)，羥脯氨酸(HYP)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DNA純化試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)，PCR試劑和引物(日本TaKaRa公司)。

1．2 方法

1．2．1 分組與造模 將小鼠分成3組，A組10只小鼠背部中央?yún)^(qū)皮下注射PBS作為對(duì)照，20只采用BLM皮下局部注射法［3］建立SSc模型，根據(jù)PF半定量評(píng)分將模型組分為B組(PF≥3分)11只和C組(PF＜3分)9只。

1．2．2 標(biāo)本采集 小鼠通過眶后動(dòng)脈放血處死，收集外周血1．0 mL，以4 000 r/min 離心 15 min，吸取上層血清，用于檢測(cè)血清IL-10。用肝素抗凝管收集小鼠外周血1．5 mL，PBS重懸，用于分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。剪下小鼠背部無(wú)毛皮膚并分成2份，一份用于檢測(cè)羥脯氨酸(HPY)含量，一份投入10%中性甲醛溶液中固定、脫水、石蠟包埋，制成4μm厚切片進(jìn)行病理觀察。打開小鼠胸腔，取出左肺上葉迅速移至－80℃冰箱保存，用于熒光定量PCR檢測(cè);左肺下葉分2份，一份用10%中性甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋，制成4μm厚的切片進(jìn)行病理觀察，另一份用于檢測(cè)HYP的含量。右肺用于提取單個(gè)核細(xì)胞(MC)。

1．2．3 皮膚、肺部炎癥及纖維化觀察 皮膚及肺組織切片做Masson和HE染色，用病理圖像分析儀系統(tǒng)軟件測(cè)量皮膚厚度［4］。皮膚和肺部炎癥評(píng)分:0分沒有，1分少許，2分輕度，3分中度，4分重度。由2位病理科醫(yī)生隨機(jī)選取左下肺組織切片區(qū)域進(jìn)行單獨(dú)閱片，觀察非重復(fù)的10個(gè)視野，放大200倍，進(jìn)行Ashcroft半定量PF評(píng)分。

1．2．4 HYP測(cè)定 采用樣本堿水解法，精確稱取肺組織和皮膚50 mg放入試管中;加入水解液1 mL，混勻，95 ℃水浴 30 min，調(diào)整 pH 6．0 ～6．8;加入適量活性炭，充分混勻，離心，取1 mL進(jìn)行檢測(cè);在波長(zhǎng)550 nm處檢測(cè)吸光度(A)值，然后換算成HYP含量(μg/mg)。

1．2．5 肺組織及外周血Th2細(xì)胞檢測(cè) 取出右肺，根據(jù)參考文獻(xiàn)［5］提取肺組織中的MC。PBMC采用Ficoll-泛影鈉不連續(xù)密度梯度離心法分離得到。采用美國(guó)BD公司四色熒光流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD+4IL-4+Th2細(xì)胞，Cell Quest流式分析軟件進(jìn)行分析。

1．2．6 肺組織IL-10 mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取小鼠左肺下葉肺組織100 mg，用Trizol法提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。膠回收純化DNA片段作為標(biāo)準(zhǔn)品，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，SYBR綠色Ⅰ核酸凝膠染料進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。各引物序列:β-肌動(dòng)蛋白上游引物為 5'-ATCCACGAAACTACCTTCAA-3'，下游引物為5'-CCAAATTGTATTGCAGATGTTCCAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 200 bp;反應(yīng)條件:94 ℃ 20 s，57．5 ℃ 30 s，72 ℃ 31 s，40 個(gè)循環(huán);IL-10上游引物為5'-CCATGGCCCAGAAATCAAGG-3'，下游引物為5'-TCTTCACCTGCTCCACTGCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物129 bp;反應(yīng)條件:95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，將IL-10 mRNA與β-肌動(dòng)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的比值為其mRNA表達(dá)量校正值，經(jīng)均一化處理后得出其相對(duì)量。所有樣本均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1．2．7 外周血IL-10檢測(cè) 采用ELISA法，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1．2．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料用ˉx±s表示，組間比較采用方差、秩和和t檢驗(yàn)分析;相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析法。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 皮膚和肺組織病理觀察 A組小鼠背部注射部位皮膚和肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生;B、C組小鼠皮膚明顯增厚，膠原纖維明顯增生，附屬器萎縮及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);見插頁(yè)Ⅰ圖2。B組肺部結(jié)構(gòu)明顯破壞，可見大量淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且有肺泡、肺間質(zhì)及支氣管壁中度以上纖維性增厚或者有纖維束的形成;C組肺部結(jié)構(gòu)無(wú)明顯破壞，肺泡、肺間質(zhì)及支氣管壁無(wú)或僅有少量纖維性增厚。各組小鼠皮膚、肺部病理及HYP水平比較，見表1。

表1 各組小鼠皮膚、肺部病理及HYP水平比較±s)

表1 各組小鼠皮膚、肺部病理及HYP水平比較±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．01;與 C 組比較，#P ＜0．01

組別 n 皮膚厚度(μm)炎癥評(píng)分(分)HYP(μg/mg)皮膚 肺部A 組 10 40．77 ±12．66 0．40 ±0．52 0．40 ±0．52 0．60 ±0．7皮膚 肺部PF評(píng)分(分)0 1．45 ±0．40 0．38 ±0．16 B 組 11 97．87 ±22．02* 2．82 ±0．75* 2．36 ±0．81*# 4．00 ±1．41*# 3．07 ±1．26* 0．64 ±0．08*#C 組 9 91．73 ±15．33* 2．44 ±0．73* 1．33 ±0．50* 1．50 ±0．76* 2．43 ±0．61*0．45 ±0．08

2．2 各組小鼠外周血、肺組織中Th2細(xì)胞比例和IL-10水平比較 見表2。

表2 各組小鼠外周血、肺組織中Th2細(xì)胞比例和 IL-10 水平比較( ±s)

表2 各組小鼠外周血、肺組織中Th2細(xì)胞比例和 IL-10 水平比較( ±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01;與 C 組比較△P ＜0．05，▽ P ＜0．01

組別 Th2細(xì)胞(%)肺組織IL-10外周血 肺組織外周血IL-10(pg/mL)mRNA A組9．90 ±7．42 7．40 ±4．93 76．82 ±25．74 8．60 ±6．88 B 組 23．23 ±5．32＊△ 23．50 ±5．40#△ 126．77 ±42．78#▽ 21．36 ±7．88#C 組 12．28 ±7．10 14．72 ±6．81 76．56 ±27．74 16．00 ±6．56*

2．3 各指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系 PF、肺部炎癥評(píng)分與皮膚厚度、炎癥評(píng)分呈正相關(guān)(r分別為0．687、0．791，P均＜0．05)，外周血、肺部Th2細(xì)胞與肺部炎癥、HYP、PF 評(píng)分呈正相關(guān)(r分別為 0．586、0．535、0．595和0．538、0．423、0．581，P 均 ＜ 0．05)。IL-10 mRNA在肺組織的表達(dá)量與肺部炎癥、HYP、PF評(píng)分呈正相關(guān)(r分別為 0．532、0．460、0．474，P 均 ＜0．05)，血清IL-10水平與肺部炎癥、HYP、PF評(píng)分呈正相關(guān)(r分別為 0．387、0．461、0．410，P 均 ＜0．05)。肺部Th2細(xì)胞與肺部IL-10 mRNA、外周血IL-10 水平呈正相關(guān)(r分別為 0．517、0．363，P 均 ＜0．05)，外周血Th2細(xì)胞與肺部IL-10 mRNA呈正相關(guān)(r=0．444，P ＜0．05)。

3 討論

小鼠背部皮下局部注射BLM，導(dǎo)致小鼠局部皮膚硬化并出現(xiàn)PF，產(chǎn)生自身抗體，且組織纖維化和自身抗體的產(chǎn)生與CD+4T細(xì)胞激活有關(guān)，這一模型很好地模擬了人類SSc-PF的主要特征［3］。本研究使用BLM在小鼠背部皮膚局部注射，與對(duì)照組比較，B、C組小鼠皮膚明顯增厚，HYP、皮膚炎癥明顯增多;且B組小鼠出現(xiàn)肺部結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡、肺間質(zhì)和支氣管壁纖維不同程度增厚，肺部炎癥和纖維化評(píng)分、HYP較A、C組明顯增多。提示造模后小鼠皮膚和肺部出現(xiàn)炎癥與纖維化病變特征，成功再現(xiàn)了SSc繼發(fā)性PF的模型。隨著皮膚厚度和炎癥加重，肺部炎癥和纖維化程度也越來越重。

PF是由多種病因引起的慢性、間歇性和廣泛的肺部疾病，其主要病理特點(diǎn)是彌漫性肺泡炎，肺間質(zhì)纖維細(xì)胞增殖，大量細(xì)胞外基質(zhì)積聚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂和PF［6］。T細(xì)胞在PF發(fā)病機(jī)制中起到重要作用。一些研究表明，Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子對(duì)于PF起主要調(diào)節(jié)作用。Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子促進(jìn)肺、皮膚等多種器官的纖維母細(xì)胞滋生和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，加強(qiáng)膠原蛋白、纖連蛋白及肌腱蛋白的合成等［2］;此外，IL-4還是成纖維母細(xì)胞強(qiáng)有力的趨化因子。有實(shí)驗(yàn)表明，抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2通過調(diào)節(jié)肺氧化水平和轉(zhuǎn)移Th1/Th2細(xì)胞間的平衡誘導(dǎo)Th1細(xì)胞反應(yīng)，可以防止BLM致PF［7］。本研究發(fā)顯示，與A組比較，B組小鼠外周血和肺部CD+4IL-4+Th2細(xì)胞數(shù)明顯增多，且與肺部炎癥評(píng)分、肺部HYP含量呈正相關(guān)，提示Th2細(xì)胞參與SSc-PF的發(fā)病，可能在PF病變中起促進(jìn)作用。另外，有研究顯示Th2細(xì)胞通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、增生，使膠原蛋白合成增加，并且能夠抑制其降解，導(dǎo)致基質(zhì)蛋白沉積和纖維組織生成，最終形成纖維化［7］。

本研究顯示，B、C組小鼠肺部IL-10 mRNA和B組外周血IL-10水平較A組明顯增高，且肺部IL-10 mRNA表達(dá)量、血清IL-10水平與肺部炎癥與纖維化評(píng)分、肺部 HYP 顯著正相關(guān)。Barbarin 等［8，9］在PF小鼠模型中發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)的IL-10可加重肺纖維化，且IL-10通過激活Th2型細(xì)胞因子，增加IL-4、IL-13等表達(dá)，促進(jìn)PF形成［10］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，IL-10可能通過CCL2/CCR2軸促使纖維細(xì)胞聚集和巨噬細(xì)胞活化最終導(dǎo)致PF［11］。最近研究表明，IL-10 主要通過上調(diào) TGF-β1、IL-4、IL-13 等表達(dá)參與PF發(fā)病，這些都提示IL-10在SSc-PF中扮演重要角色。在Th0細(xì)胞分化過程中，IL-10可抑制Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，誘導(dǎo)其向Th2細(xì)胞分化，且Th2也能產(chǎn)生IL-10。本研究發(fā)現(xiàn)，Th2與IL-10呈正相關(guān)，推測(cè)IL-10的增高可能與Th2增高有關(guān)，兩者在SSc-PF發(fā)病中可能起促進(jìn)作用。

總之，Th2細(xì)胞和IL-10在SSc-PF小鼠模型外周血、肺組織表達(dá)增高，且與肺部炎癥和纖維化呈正相關(guān)，兩者可能促進(jìn)SSc-PF發(fā)病，抑制Th2細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子將有可能成為未來治療SSc-PF的靶點(diǎn)。

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