一個(gè)基于NBD-NH2熒光團(tuán)的增強(qiáng)型pH熒光探針及其細(xì)胞造影研究

李 靜 朱成成 何衛(wèi)江

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)

許多細(xì)胞生理過程如細(xì)胞增殖和凋亡[1]、黏附[2]以及胞內(nèi)離子輸運(yùn)與動(dòng)態(tài)平衡[3]等都涉及到質(zhì)子化或去質(zhì)子化過程，并因細(xì)胞微環(huán)境pH的改變而發(fā)生變化，因此精確檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH(pHi)對(duì)于理解細(xì)胞的生理和病理過程非常重要。相比于其他pH測(cè)定方法，熒光探針法進(jìn)行pHi檢測(cè)由于靈敏度高、選擇性好、無損傷等優(yōu)點(diǎn)已成為pHi檢測(cè)的主要手段。由于該方法可對(duì)pHi進(jìn)行實(shí)時(shí)原位檢測(cè)，為理解胞內(nèi)快速生理過程提供更為真實(shí)可靠的信息，因此pH熒光探針技術(shù)已是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具之一，而發(fā)展高性能pHi熒光探針則將為該技術(shù)的應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的pH熒光探針大多是熒光素[4]、羅丹明[5]和氟硼二吡咯甲川類(BODIPY)熒光分子的衍生物[6]。這些探針主要通過識(shí)別基團(tuán)的質(zhì)子化/去質(zhì)子化來改變信號(hào)團(tuán)的熒光而實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)。然而許多具有pH熒光響應(yīng)能力的探針由于生物相容性低、細(xì)胞膜透過性差和激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)短等不足難以實(shí)現(xiàn)pHi的熒光造影[7-9]。由于細(xì)胞內(nèi)pH大多在近中性，生理和病理?xiàng)l件下的pH變化也往往發(fā)生在近中性或弱酸性范圍內(nèi)，因此發(fā)展響應(yīng)范圍在近中性或弱酸性范圍內(nèi)的pH探針十分重要。前述的熒光素、羅丹明和BODIPY是細(xì)胞研究中最常用的幾種熒光團(tuán)，因此發(fā)展基于其他熒光團(tuán)的pH探針也有利于進(jìn)行細(xì)胞多重共染研究。由于4-氨基-7-硝基-1，2，3-苯并呋咱(NBD-NH2)熒光團(tuán)是基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制(ICT)的熒光團(tuán)，其較大的Stokes位移有利于克服造影中激發(fā)光的干擾。其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都在可見光區(qū)域，有利于克服細(xì)胞造影過程中的自發(fā)熒光干擾和光毒性等問題。該熒光團(tuán)同時(shí)具有合適的量子產(chǎn)率、良好的生物相容性和光 穩(wěn)定性[10-11]，已被用于氨基酸[12]、羧甲基纖維素[13]、Zn2+[14]、Hg2+[15]等熒光探針的構(gòu)建。因此本研究擬利用NBDNH2熒光團(tuán)來構(gòu)建在弱酸或近中性條件下具有pH響應(yīng)能力的熒光探針。

本研究中我們選用NBD-NH2作為熒光團(tuán)、N-(4-吡啶甲基)乙二胺作為質(zhì)子的響應(yīng)基團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一個(gè)基于光致電子轉(zhuǎn)移(PET)機(jī)制的pH熒光探針NBD-Py，它的合成路線如式1所示。研究同時(shí)還合成了該探針不含吡啶的類似物NBD-en，用以對(duì)比它們的pH熒光響應(yīng)行為。Taliani等曾合成該類似物作為中間體與苯基吲哚二酮偶聯(lián)作為外周型苯二氮卓類受體的熒光探針[16]。探針NBD-Py中的N-(4-吡啶甲基)乙二胺作為質(zhì)子受體，其吡啶N和二烷基胺N均可通過PET效應(yīng)猝滅NBD-NH2的熒光[17]。該受體質(zhì)子化時(shí)可阻斷PET效應(yīng)并導(dǎo)致探針熒光增強(qiáng)。設(shè)計(jì)中選擇4-吡啶甲基而非常見的2-吡啶甲基的連接方式，目的是盡量避免形成適于金屬配位的1，4-螯合結(jié)構(gòu)以降低金屬對(duì)探針pH響應(yīng)行為的干擾。其類似物NBD-en的質(zhì)子受體為乙二胺，質(zhì)子化乙二胺的pKa約為10.66，但NBD-en本身的pKa約在8.29，無法應(yīng)用于中性或弱酸性pH的檢測(cè)。雖然質(zhì)子化吡啶的pKa約為5.19，本研究發(fā)現(xiàn)吡啶與乙二胺在NBD-Py中的組合可以使整個(gè)受體質(zhì)子化后的表觀pKa接近7.0，從而獲得對(duì)弱酸和近中性pH響應(yīng)的能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

合成NBD-Cl的原料2，6-二氯苯胺為國(guó)內(nèi)工業(yè)品，4-吡啶甲醛購(gòu)買于Sigma公司。NBD-en根據(jù)文獻(xiàn)合成[16]。合成實(shí)驗(yàn)中所用溶劑和其他試劑均來自南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院采購(gòu)的國(guó)產(chǎn)試劑，使用前未做進(jìn)一步純化。所有光譜測(cè)試中使用的溶劑都是購(gòu)自Aldrich公司的光譜純?nèi)軇盟荕ILIPORE處理的超純水。核磁共振譜在Bruker DRX-500核磁儀 (500 MHz)上采集，高分辨質(zhì)譜由Bruker AutoflexⅡMALDI-TOF測(cè)定。熒光光譜由Fluoromax-4熒光光譜儀記錄，紫外-可見光譜用Perkin Elmer Lambda 35紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定。pH值用Sartorius PB-10精密pH計(jì)測(cè)定。熒光造影用OLYMPUS IX81激光共聚焦熒光顯微鏡完成。

1.2 NBD-Py的合成和表征

NBD-Py的合成路線如式1所示，其中NBD-Cl和N-(4-吡啶甲基)乙二胺分別根據(jù)文獻(xiàn)方法在本實(shí)驗(yàn)室合成[18-19]。將 10 mL NBD-Cl(400 mg，2 mmol)甲醇溶液攪拌下逐滴加入到N-(4-吡啶甲基)乙二胺(300 mg，2 mmol)的甲醇溶液中(10 mL)。在室溫條件下維持反應(yīng)并用TLC(VCH2Cl2/VCH3OH=20)跟蹤至原料反應(yīng)完全。減壓脫去溶劑后殘余物通過硅膠柱層析

(VCH2Cl2/VCH3OH=25)分離得到橘黃色固體NBD-Py(106 mg，yield 16.9%)。1H NMR(500 MHz，(CD3)2SO)δ：2.84(t，J=6.2，2H)，3.60(t，J=6.2，2H)，3.78(s，2H)，6.45 (d，J=8.9，1H)，7.34 (d，J=5.7，2H)，8.47 (d，J=5.7，2H),8.51(d，J=8.9，1H)。13C NMR(125 MHz，(CD3)2SO) δ：43.92,47.02,51.70,99.73,121.04,123.41,138.32,144.60,144.94,145.90,149.82and150.23。ESI-HRMS(positive mode，m/z)：calcd.315.1206；Found 315.1201 for[M+H]+。

式1 化合物NBD-en和探針NBD-Py的合成Scheme 1 Compound NBD-en and the synthesis of NBD-Py

1.3 NBD-Py和NBD-en的光譜測(cè)試

將NBD-Py的儲(chǔ)備液用HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3；pH 7.40)稀釋成 10 μmol·L-1溶液(VDMSO∶VHEPES=1∶99)，然后分別測(cè)量探針的熒光光譜和紫外-可見吸收光譜。量子產(chǎn)率測(cè)定時(shí)選用 4-甲氨基-7-硝基-1，2，3-苯并呋咱(NBD-NHCH3)作為基準(zhǔn)物[20]，以其最大激發(fā)波長(zhǎng)458 nm為NBD-Py探針的激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)基準(zhǔn)物和探針分別進(jìn)行紫外吸收測(cè)定與熒光光譜測(cè)定。量子產(chǎn)率通過如下公式進(jìn)行計(jì)算[21]：

Φf表示量子產(chǎn)率，公式中下標(biāo)R與S分別代表基準(zhǔn)物與樣品，A表示相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度，n為樣品溶液的折射系數(shù)，F(xiàn)表示化合物溶液熒光發(fā)射光譜的積分面積。

NBD-Py的pH滴定和響應(yīng)可逆性實(shí)驗(yàn)在含1%DMSO的水溶液中進(jìn)行。儲(chǔ)備液用H2O稀釋成10 μmol·L-1。溶液pH的調(diào)節(jié)是通過加入少量(幾微升)的HCl或NaOH水溶液，在迅速測(cè)定pH后快速完成紫外-可見吸收光譜或熒光光譜測(cè)試。NBD-Py對(duì)金屬離子的熒光響應(yīng)性能在DMSO/HEPES(1∶99，V/V，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH 7.40)中測(cè)試，測(cè)試濃度是 10 μmol·L-1，其中堿金屬和堿土金屬的離子濃度是探針濃度的1 000倍，而其他金屬離子和探針濃度相等。

1.4 NBD-Py探針的細(xì)胞造影研究

利用熒光共聚焦顯微鏡考察了NBD-Py對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)pH的造影能力。細(xì)胞內(nèi)pH的調(diào)節(jié)是通過在孵育介質(zhì)中加入尼日利亞菌素 (10 ng·mL-1)使細(xì)胞內(nèi)外pH一致，再通過調(diào)節(jié)孵育介質(zhì)的pH實(shí)現(xiàn)的[22]。具體操作為室溫下將HeLa細(xì)胞與探針NBD-Py(10 μmol·L-1)共同孵育 30 min，孵化的介質(zhì)為含有尼日利亞菌素且具有不同pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5和7.0)的PBS緩沖溶液。造影直接用Olympus IX81激光共聚焦熒光顯微鏡完成。通過和溶酶體熒光染色試劑 (Lysotracker Red DND-99)對(duì)HeLa細(xì)胞共染確定了NBD-Py探針的溶酶體靶向性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 NBD-Py和NBD-en的紫外和熒光光譜

首先我們研究了NBD-Py探針在DMSO/HEPES(1∶99，V/V，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40)體系中的光譜行為。如圖1所示，NBD-Py探針最大紫外吸收波長(zhǎng)為475 nm(消光系數(shù)6.5×104L·mol-1·cm-1)，在 344 nm 處還有一弱吸收峰(消光系數(shù) 2.1×104L·mol-1·cm-1)。它們可以分別指認(rèn)為探針分子4-氨基與7-硝基間的ICT效應(yīng)所引起的吸收峰(ICT帶)和NBD熒光團(tuán)本身的π-π*躍遷吸收帶。其類似物NBD-en的ICT和π-π*吸收峰的位置與NBD-Py基本相似，消光系數(shù)也相似(467 nm，4.5×104L·mol-1·cm-1；336 nm，1.5×104L·mol-1·cm-1)。探針NBD-Py的最大激發(fā)波長(zhǎng)與最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為465和539 nm，均處于可見光區(qū)，其較大的Stokes位移(74 nm)，有助于降低造影過程中激發(fā)光的干擾。其類似物NBD-en的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為464和533 nm。從圖1可以看出NBD-Py的量子產(chǎn)率要小于NBD-en，而實(shí)際以NBD-NHCH3作為基準(zhǔn)物進(jìn)行的量子產(chǎn)率測(cè)定也表明NBD-Py的量子產(chǎn)率為0.011，而NBD-en則為0.028。

圖1 NBD-en(10 μmol·L-1,實(shí)線)和 NBD-Py(10 μmol·L-1,虛線)在含1%DMSO HEPES緩沖溶液(50 mmol·L-1,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40) 中 的 紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜Fig.1 UV-Vis absorption and emission spectra of NBD-en(10 μmol·L-1;solid line)and NBD-Py(10 μmol·L-1;dashed line)in HEPES buffer(50 mmol·L-1,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40)containing 1%DMSO

2.2 NBD-Py的紫外可見和熒光pH滴定

圖2 NBD-Py(10 μmol·L-1,VDMSO/VH2O=1/99)水溶液在不同pH條件下的吸收光譜Fig.2 UV-vis absorption spectra of NBD-Py(10 μmol·L-1)obtained in aqueous solution(VDMSO/VH2O=1/99)at different pH values

NBD-Py探針的pH紫外-可見光譜滴定實(shí)驗(yàn)是在含1%DMSO的水溶液中進(jìn)行的。如圖2所示，NBD-Py探針的吸收光譜在pH 3.4～10.97范圍內(nèi)變化不明顯，474 nm處吸收有微弱的下降，而344 nm處的吸收有微弱上升，同時(shí)未觀察到吸收峰的移動(dòng)。作為ICT熒光團(tuán)，其穩(wěn)定的吸收光譜表明其作為電子給體的4-氨基在此pH范圍內(nèi)沒有發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化效應(yīng)，然而這不能排除側(cè)鏈氨基或吡啶發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化作用。

NBD-Py的pH熒光滴定在同樣的溶液中完成。如圖3(a)所示，NBD-Py在pH 3.0～5.0之間具有較強(qiáng)的熒光，并且相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)pH進(jìn)一步升高時(shí)NBDPy的熒光強(qiáng)度逐漸降低，直至當(dāng)pH＞8.0時(shí)，NBDPy的熒光強(qiáng)度再次趨于穩(wěn)定。在pH逐漸升高的過程中其熒光發(fā)射波長(zhǎng)未見移動(dòng)，這也表明pH變化過程中NBD-NH2熒光團(tuán)的ICT效應(yīng)沒有變化，也表明給電子基4-氨基未發(fā)生質(zhì)子化，這也與紫外pH滴定的結(jié)果相一致。顯然，NBD-Py在pH 5.0～8.5范圍內(nèi)顯示的pH依賴的熒光強(qiáng)度變化與探針質(zhì)子受體中側(cè)鏈氨基或吡啶的質(zhì)子化有關(guān)。當(dāng)pH＞8.0時(shí)，側(cè)鏈氨基和吡啶均未質(zhì)子化，相應(yīng)N原子上的孤對(duì)電子可以發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移(PET)而猝滅熒光團(tuán)的熒光，NBD-Py顯示較弱的熒光。當(dāng)pH逐漸降低時(shí)，側(cè)鏈氨基和吡啶逐漸發(fā)生質(zhì)子化，相應(yīng)的PET效應(yīng)被抑制并導(dǎo)致熒光團(tuán)熒光逐漸恢復(fù)，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)pH＜5.0時(shí)，側(cè)鏈氨基和吡啶已被完全質(zhì)子化，PET效應(yīng)完全被阻斷，熒光達(dá)到最強(qiáng)。NBD-Py熒光的pH依賴行為表明該探針是一個(gè)基于PET機(jī)制的pH熒光探針，其質(zhì)子化導(dǎo)致的熒光增強(qiáng)倍數(shù)達(dá)到～9.0(FpH5.0/FpH8.5)。利用NBD-Py探針最大發(fā)射波長(zhǎng)539 nm處的熒光強(qiáng)度對(duì)pH作圖，得到圖3(b)顯示的熒光pH滴定曲線。利用Henderson-Hasselbach方程對(duì)該滴定曲線進(jìn)行擬合的結(jié)果表明NBD-Py探針的pKa為～6.48[23]。這一數(shù)值表明該探針適合于中性到弱酸性pH的檢測(cè)，達(dá)到了研究的設(shè)計(jì)目的。

圖3 (a)NBD-Py水溶液(10 μmol·L-1,VDMSO/VH2O=1/99,λex=465 nm)在不同pH條件下的熒光發(fā)射光譜;(b)基于539 nm處熒光強(qiáng)度的pH滴定曲線(■)及pKa擬合曲線Fig.3 (a)Emission spectra of NBD-Py(10 μmol·L-1)in aqueous solution(VDMSO/VH2O=1/99)obtained at different pH values(pH 3.79～10.97);(b)Fluorescent pH titration profile based on the normalized emission intensity at 539 nm(■)and the related pKasimulation profile;λex=465 nm

圖4 NBD-en 水溶液(10 μmol·L-1,VDMSO/VH2O=1/99,λex=465 nm)在不同pH的熒光發(fā)射光譜。插圖為基于533 nm處熒光強(qiáng)度的pH滴定曲線(■)及pKa擬合曲線Fig.4 Emission spectra of NBD-en(10 μmol·L-1)in aqueous solution(VDMSO/VH2O=1∶99)obtained at different pH values(pH 3.10～12.04);Inset is the fluorescent pH titration profile based on the normalized emission intensity at 533 nm and the related pKasimulation profile;λex=465 nm

NBD-en的pH熒光滴定表明其熒光在pH＜7.0時(shí)最強(qiáng)，而且其強(qiáng)度在此范圍內(nèi)不受pH影響。在pH 7.0～10.5范圍時(shí)，該化合物的熒光強(qiáng)度隨著pH值的升高而逐漸降低，而發(fā)射波長(zhǎng)沒有明顯的移動(dòng)。在pH高于10.0以上時(shí)熒光趨于穩(wěn)定。在pH 7.0～10.5范圍內(nèi)pH依賴的熒光變化同樣可以歸結(jié)為側(cè)鏈氨基在較低pH時(shí)(pH＜10.0)發(fā)生質(zhì)子化有效阻斷側(cè)鏈氨基的PET效應(yīng)所致。NBD-en探針側(cè)鏈氨基質(zhì)子化導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)倍數(shù)約為16(FpH6.91/FpH9.88)。擬合發(fā)現(xiàn)NBD-en的pKa約為8.29。比較NBD-Py與NBD-en的pKa可以發(fā)現(xiàn)吡啶的引入有效地將熒光分子中質(zhì)子受體的pKa從8.29降低到6.48。一般認(rèn)為仲胺的堿性要強(qiáng)于伯胺，所以NBDPy結(jié)合質(zhì)子能力低于NBD-en的原因是吡啶結(jié)構(gòu)本身的影響而非伯胺轉(zhuǎn)變?yōu)橹侔匪?。?shí)際上在NBD-Py探針中存在著側(cè)鏈氨基和吡啶的兩個(gè)質(zhì)子化過程，這兩個(gè)質(zhì)子化過程相互影響，導(dǎo)致了居中的表觀pKa。顯然，這一調(diào)節(jié)質(zhì)子受體pKa的策略應(yīng)可作為調(diào)節(jié)pH熒光探針pH響應(yīng)范圍的有效手段。

2.3 NBD-Py探針pH響應(yīng)行為的抗金屬干擾能力和可逆性

細(xì)胞中存在大量高濃度的化學(xué)物種，它們均可能與探針發(fā)生相互作用而影響探針的pH響應(yīng)行為，尤其胞內(nèi)的陽離子往往會(huì)與質(zhì)子相競(jìng)爭(zhēng)。其中高濃度的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+和一些其他常見的過渡金屬離子的影響往往比較明顯。實(shí)用的胞內(nèi)pH造影探針其pH響應(yīng)行為應(yīng)不受胞內(nèi)其他金屬離子的干擾。本研究對(duì)NBD-Py的抗金屬干擾能力也進(jìn)行了測(cè)試。測(cè)試的介質(zhì)為pH 7.40的HEPES緩沖溶液，測(cè)試中引入高濃度的堿金屬或堿土金屬離子是為模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。由圖5(a)可以看出，當(dāng)與探針等量的過渡金屬離子如 Fe3+、Zn2+、Cu2+、Hg2+、Cd2+等加入到NBD-Py探針溶液中時(shí)，其熒光強(qiáng)度及發(fā)射波長(zhǎng)均未發(fā)生明顯的變化。另外加入探針1 000倍量的 Na+、K+、Ca2+或 Mg2+同樣未影響探針的熒光。這一結(jié)果表明NBD-Py探針能專一地響應(yīng)pH而不受胞內(nèi)常見金屬離子的干擾。這一優(yōu)點(diǎn)應(yīng)與設(shè)計(jì)中選擇4-吡啶甲基修飾乙二胺盡量減少質(zhì)子受體對(duì)金屬的螯合作用有關(guān)。這些結(jié)果表明NBD-Py具有胞內(nèi)pH造影的前景。

圖5 (a)NBD-Py(10 μmol·L-1)在 HEPES 緩沖體系(VDMSO/VHEPES=1/99,50 mmol·L-1HEPES,100 mmol·L-1KNO3,pH 7.40)中對(duì)各種金屬離子的熒光響應(yīng)(根據(jù) 535 nm處熒光強(qiáng)度繪制，過渡金屬離子濃度為10 μmol·L-1，K+、Na+、Ca2+、Mg2+濃度為 10 mmol·L-1);(b)NBD-Py 在 pH 4.50～9.45 間振蕩時(shí)在 535 nm 處的熒光變化;λex=465 nmFig.5 (a)Fluorescence responses of NBD-Py(10 μmol·L-1)in aqueous solution(VDMSO/Vwater,1/99;50 mmol·L-1 HEPES,100 mmol·L-1KNO3;pH=7.40)to different metal cations based on the emission at 535 nm.The final concentration of Na+,K+,Ca2+and Mg2+is 10 mmol·L-1,respectively,while those for other cations are 10 μmol·L-1;(b)Fluorescence intensity of NBD-Py at 535 nm upon adjusting pH between 4.50 and 9.45 pH in a reversible manner;λex=465 nm

由于細(xì)胞內(nèi)pH值往往發(fā)生振蕩變化，并且非均勻分布，因此pH探針具有可逆響應(yīng)能力十分重要。因此我們還對(duì)NBD-Py對(duì)pH響應(yīng)的可逆性進(jìn)行了測(cè)試。實(shí)驗(yàn)中我們循環(huán)調(diào)節(jié)測(cè)試溶液的pH使其pH在4.50和9.45之間振蕩，并反復(fù)測(cè)試其熒光光譜。如圖5(b)所示，NBD-Py的熒光至少在4個(gè)循環(huán)內(nèi)在相同的pH下保持穩(wěn)定，表明該探針具有較好的可逆響應(yīng)pH的能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH振蕩變化的有效響應(yīng)。

2.4 NBD-Py細(xì)胞造影研究

圖6 NBD-Py對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)pH的激光共聚焦熒光造影圖。HeLa細(xì)胞分別用含NBD-Py(10 μmol·L-1)的具有不同pH的PBS緩沖溶液孵育30min(25℃)進(jìn)行造影測(cè)試。介質(zhì)中同時(shí)含有尼日利亞菌素(10 ng·mL-1);(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)分別是在pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0條件下孵育的細(xì)胞造影圖，造影熒光通道為500～600 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm;(h)為經(jīng)歸一化后細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度對(duì)pH的變化曲線Fig.6 Confocal pHiimaging of HeLa cells stained by NBD-Py(10 μmol·L-1)at different pH values;The cells were incubated for 30 min with NBD-Py in PBS buffers of different pH at 25C,which containing nigericin(10 ng·mL-1);(a)pH 4.0;(b)pH 4.5;(c)pH 5.0;(d)pH 5.5;(e)pH 6.0;(f)pH 6.5;(g)pH 7.0;Band path:500～600 nm;excitation,488 nm;(h)Normalized average intracellular fluorescent intensity versus pHi

圖7 在 pH 為 4.0室溫條件下，用 10 μmol·L-1NBD-Py和 1 μmol·L-1LysoSensor Red DND-99孵化 30 min后的HeLa細(xì)胞共聚焦造影圖;(a)HeLa細(xì)胞明場(chǎng)圖;(b)488 nm激發(fā)時(shí)下由500到600 nm造影通道獲得的造影圖;(c)565 nm激發(fā)時(shí)下由570到600 nm造影通道獲得的造影圖;(d)為(b)和(c)的疊合圖Fig.7 Confocal imaging of HeLa cells constained by 10 μmol·L-1NBD-Py and 1 μmol·L-1LysoSensor Red DND-99 after incubation for 30 min at 25℃(pH 4.0):(a)Bright field image;(b)image obtained with a band path from 500 to 600 nm upon excitation at 488 nm(NBD-Py);(c)image obtained with a band path from 570 to 600 nm upon excitation at 565 nm(LysoSensor Red DND-99);(d)overlay of(b)and(c)

利用共聚焦熒光顯微鏡我們進(jìn)一步考察了NBD-Py細(xì)胞內(nèi)pH造影能力。造影使用的HeLa細(xì)胞與探針 NBD-Py(10 μmol·L-1)共同孵育 30 min,孵育的介質(zhì)為加入了尼日利亞菌素(10 ng·mL-1)的具有不同pH的PBS緩沖溶液。孵育結(jié)束后進(jìn)行單通道模式共聚焦造影。如圖6所示，當(dāng)孵育溶液pH為4.0時(shí)，HeLa細(xì)胞內(nèi)顯示的平均熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。當(dāng)pH逐漸升高時(shí)，胞內(nèi)熒光逐漸減弱，直至pH7.0時(shí)熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。胞內(nèi)pH的熒光響應(yīng)圖(圖6h)表明該探針在HeLa細(xì)胞內(nèi)可在pH 4.0～6.5內(nèi)線性響應(yīng)pHi。這一響應(yīng)趨勢(shì)和行為類似于溶液中觀察到的現(xiàn)象，但顯然其響應(yīng)的線性范圍與溶液中略有不同，胞內(nèi)環(huán)境與溶液模擬環(huán)境之間的區(qū)別可能是導(dǎo)致這一差異的原因。胞內(nèi)pH造影表明NBD-Py具有良好的細(xì)胞膜透過能力，并且具有pHi響應(yīng)能力，是一個(gè)可對(duì)弱酸性胞內(nèi)環(huán)境進(jìn)行pH造影的良好探針。同時(shí)該探針具有良好的細(xì)胞相容性，在測(cè)試過程中未見明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。同時(shí)從圖6(a～g)可以看出，探針主要分布于胞漿中，顯示了清晰的點(diǎn)狀熒光分布，表明探針可能具有特定細(xì)胞器的選擇性結(jié)合能力。為了進(jìn)一步確定NBD-Py探針的亞細(xì)胞分布，我們利用溶酶體熒光染色試劑Lysotracker Red DND-99和NBD-Py探針對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行了共定位研究。由圖7d可知，NBD-Py和Lysotracker Red DND-99的熒光在細(xì)胞中有很好的重疊，兩者的共定位系數(shù)達(dá)90%以上。因此可以認(rèn)為NBD-Py具有較好的溶酶體靶向能力，可以有效地檢測(cè)溶酶體的pH變化。

3 結(jié) 論

本文將4-吡啶甲基修飾乙二胺形成的質(zhì)子受體與NBD-NH2熒光團(tuán)偶聯(lián)構(gòu)建了一個(gè)具有在弱酸性和近中性pH范圍內(nèi)敏感響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)pH的熒光探針NBD-Py。該探針在pH 5.0～8.5范圍內(nèi)顯示隨pH降低導(dǎo)致的熒光增強(qiáng)響應(yīng)，并且顯示了良好的可逆響應(yīng)能力和抗金屬干擾性能，pKa約為6.48。研究表明探針質(zhì)子受體中吡啶的引入是導(dǎo)致其弱酸和近中性pH響應(yīng)的關(guān)鍵。細(xì)胞造影研究不僅證實(shí)了其pHi造影能力，而且發(fā)現(xiàn)了其良好的溶酶體靶向性能，為研究細(xì)胞溶酶體pH相關(guān)生理和病理過程提供了可靠工具。

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