自體顱骨粉末移植和膜引導(dǎo)再生技術(shù)修復(fù)兔顱骨缺損的組織學(xué)研究

陳敏建 陸婷 陳平

應(yīng)用自體顱骨粉末移植和膜引導(dǎo)性再生技術(shù)修復(fù)顱骨缺損，在之前的動物實驗研究中已被證實是一種快速有效的方法，但其組織學(xué)演變過程并不清楚。本實驗旨在對該問題進行探討，以更好地指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與實驗動物

1.1.1 主要材料

聚-DL-乳酸（PDLLA）可吸收生物膜，厚0.2 mm，大小1.5 mm×1.5 mm （成都迪康中科生物醫(yī)學(xué)材料有限公司）；醫(yī)用生物蛋白膠（廣州倍繡生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 實驗動物

新西蘭大白兔50只，普通級 （許可證號：SCXK2007-0001），體質(zhì)量為 2.0~2.5 Kg，雌雄不限，由福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所實驗動物中心提供。

1.2 缺損模型制作

手術(shù)前一天用8%Na2S溶液行手術(shù)區(qū)化學(xué)脫毛備皮。以鹽酸氯胺酮30 mg/Kg加氟哌利多1 mg/Kg肌肉注射麻醉，顱頂正中切口，長約5 cm，切開皮膚、皮下組織及顱骨膜，顱骨膜下充分暴露顱頂骨，用手搖鉆和顱骨鉆鉆孔形成1個直徑為1 cm的顱骨全層缺損。同時仔細(xì)搜集顱骨鉆孔時形成的骨粉備用。骨缺損處移植收集備用的骨粉，約1 mL，表面涂以適量的醫(yī)用生物蛋白膠固定，移植骨粉的上面放置可吸收生物膜，切除對應(yīng)部位的顱骨膜，生物膜超過缺損邊緣2 mm。皮膚、皮下組織及顱骨膜0號絲線全層間斷縫合，關(guān)閉切口。術(shù)后肌注青霉素抗炎5 d，單只置籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由活動。 術(shù)后 2、4、6、8、12周取材行組織學(xué)觀察。

1.3 組織學(xué)觀察

取材時沿缺損邊緣0.5 cm正常顱骨處完整鑿下標(biāo)本，用6.8%硝酸脫鈣2周，每天換液2~3次，清水持續(xù)沖洗12 h，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，鏡下觀察，顯微攝影。

2 結(jié)果

本組實驗動物共50只，其中有2只在手術(shù)過程中死亡，有8只拒食死亡，其余實驗動物存活良好。在實驗過程中，飲食、大小便、行為等均未發(fā)現(xiàn)異常，切口均無感染，愈合良好。

2.1 術(shù)后2周

缺損區(qū)周邊可見大量細(xì)小的新生編織骨，編織骨之間相連或不相連，其表面可見一層成骨細(xì)胞覆蓋，編織骨間見大量的毛細(xì)血管截斷面，每高倍視野下約26~32個，毛細(xì)血管周圍是成纖維組織；往中央方向，可見一明顯的界線，該界線主要由成纖維組織形成，界線的周邊側(cè)可見成纖維組織對骨粉的包裹，巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞對骨粉的吞噬，同時可見大量的島狀或不規(guī)則條狀的編織骨，及其表面和周圍大量的成骨細(xì)胞；界線的中央側(cè)可見骨粉為大量的成纖維組織包裹，纖維組織內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤，而纖維組織內(nèi)只見少量毛細(xì)血管的截斷面，每高倍視野下約8~14個。新形成編織骨與正常骨有連接，但界限非常清楚（圖1）。

2.2 術(shù)后4周

術(shù)后4周時仍可見術(shù)后2周時觀察到的 “界線”，該界線已明顯向中央內(nèi)移，留下的骨粉明顯減少，形成的編織骨明顯增多；在缺損的周邊部形成的編織骨較為粗壯，形成了初級骨髓腔，腔內(nèi)可見破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、纖維間充質(zhì)組織、脂肪細(xì)胞空泡和少量的毛細(xì)血管截面。由周邊部向中央部觀察，越靠周邊部的編織骨越粗壯，聯(lián)系也越緊密，其骨髓腔在成分和形態(tài)上越接近正常骨髓腔，越靠近中央部的編織骨越細(xì)，仍可見孤立性骨島。新形成編織骨與正常骨的界限清晰可辨。

2.3 術(shù)后6周

大部分標(biāo)本沒有觀察到移植的骨粉，在缺損的中央部可見孤立性的骨島及其周圍的成纖維組織，纖維組織內(nèi)毛細(xì)血管截面較少。形成的編織骨越靠近中央部越細(xì)，彼此的聯(lián)系越稀疏，骨髓腔內(nèi)的成分可見破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、纖維間充質(zhì)組織、脂肪細(xì)胞空泡和少量的毛細(xì)血管截面；編織骨越靠近缺損周邊越粗壯，彼此的聯(lián)系越緊密，骨髓腔內(nèi)的成分越簡單，周邊部編織骨骨髓腔內(nèi)成分與正常骨骨髓無明顯區(qū)別。新骨與正常骨的界限仍可辨別（圖2）。

2.4 術(shù)后8周

缺損中央部形成單層的編織骨，沒有骨髓腔，向周邊逐漸形成兩層的編織骨和骨髓腔，腔內(nèi)可見破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，間充質(zhì)組織，少量毛細(xì)血管截斷面，編織骨越靠近缺損周邊越粗壯，并逐漸形成板狀，彼此的聯(lián)系越緊密，周邊與正常骨完全融合。

2.5 術(shù)后12周

缺損中央部形成雙層的編織骨，且編織骨有所增粗，在內(nèi)外板的位置形成板狀層，相對較薄，編織骨之間的連接更加緊密，形成明顯的骨髓腔。高倍視野下，腔內(nèi)可見大量的白細(xì)胞浸潤和巨噬細(xì)胞，在骨髓腔編織骨表面可見破骨細(xì)胞和大量的成骨細(xì)胞，局部腔內(nèi)僅見間充質(zhì)組織。由缺損中央部向周邊部延伸，編織骨逐漸粗壯，骨髓腔逐漸成熟，腔內(nèi)容物逐漸與正常骨髓腔一致，形成的內(nèi)外板厚度逐漸增厚，周邊部與正常骨內(nèi)外板一致（圖3）。

圖1 術(shù)后2周骨缺損區(qū)組織學(xué)觀察（HE，×20）Fig.1 Histological observation of bone defect area 2 weeks after operation(HE,×20)

圖2 術(shù)后6周骨缺損區(qū)組織學(xué)觀察（HE，×10）Fig.2 Histological observation of bone defect area 6 weeks after operation(HE,×10)

圖3 術(shù)后12周骨缺損區(qū)組織學(xué)觀察Fig.3 Histological observation of bone defect area 12 weeks after operation

3 討論

骨引導(dǎo)再生有以下要求：有成骨細(xì)胞或具有能分化為成骨細(xì)胞的細(xì)胞；有促使未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)性刺激；有組織可以長入的支架。骨誘導(dǎo)是在特定的生長因子作用下，使間充質(zhì)細(xì)胞的聚集反應(yīng)過程朝著形成軟骨或骨的方向發(fā)展。誘導(dǎo)成骨必須具備三個條件，即：誘導(dǎo)刺激物，間充質(zhì)細(xì)胞和有利于骨生長的血液供應(yīng)環(huán)境。

本實驗的組織學(xué)觀察結(jié)果顯示,骨粉移植后逐漸被吸收并形成新骨；新骨的形成是從缺損周邊開始，逐漸向缺損中央部推進的一個過程；部分標(biāo)本可以觀察到生物膜下新骨形成活躍，較硬腦膜下新骨形成有明顯優(yōu)勢；毛細(xì)血管在新骨形成區(qū)域的數(shù)量較骨粉區(qū)和新骨改建區(qū)域明顯增多；炎性細(xì)胞的浸潤主要存在于骨粉區(qū)域，在新骨形成區(qū)域少見。

上述結(jié)果說明，移植的骨粉是一種很強的誘導(dǎo)刺激物，同時具有支架作用；骨粉本身含有少量成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，但新骨形成所需的成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞主要來源于缺損周圍的骨髓腔和血液供應(yīng)；生物膜的存在，一定程度上也為新骨的形成提供了支架的作用；在缺損修復(fù)的早中期，在同一時間段可以觀察到新骨形成的不同階段，說明骨誘導(dǎo)生長因子在同一時段不同區(qū)域和同一區(qū)域不同時段的表達(dá)是不同的。膜引導(dǎo)下骨粉移植修復(fù)顱骨缺損的實質(zhì)就是膜引導(dǎo)下的引導(dǎo)性和誘導(dǎo)性骨再生的過程。

膜引導(dǎo)下骨粉移植修復(fù)顱骨缺損的組織學(xué)演變過程如下：骨粉移植入顱骨缺損后，作為強烈的骨再生誘導(dǎo)刺激物，引起血液中的炎性細(xì)胞大量向缺損區(qū)域轉(zhuǎn)移浸潤。在炎性細(xì)胞的作用下骨誘導(dǎo)因子向缺損內(nèi)轉(zhuǎn)移浸潤，在骨誘導(dǎo)因子的作用下大量的毛細(xì)血管由缺損周圍向缺損內(nèi)增生生長，在毛細(xì)血管周圍形成大量未分化的間充質(zhì)細(xì)胞并包裹骨粉，和骨粉本身的間充質(zhì)細(xì)胞一起[1]，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白作用下形成成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞[2]。在破骨細(xì)胞作用下，骨粉被逐漸吞噬吸收，同時在成骨細(xì)胞的作用下，新的編織骨形成，形成的骨小梁是不規(guī)則的，大小形態(tài)不一，相互連接成立體網(wǎng)狀，并逐漸增粗。在骨誘導(dǎo)因子的調(diào)控下、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的作用下，新的編織骨進行改建，在顱骨內(nèi)外板的位置形成板層骨，在板障的位置形成骨髓，并逐漸成熟。在此強調(diào)，骨粉移植修復(fù)顱骨缺損的組織學(xué)演變過程，是一個從缺損周邊向缺損中央逐步推進的過程。該過程與陳敏建此前的實驗研究完全一致[3-4]。生物膜有效地阻止了結(jié)締組織向缺損內(nèi)生長，同時生物膜的存在也為骨引導(dǎo)再生提供了一定空間，此外，生物膜有聚集骨誘導(dǎo)因子提高骨誘導(dǎo)因子濃度的作用[5]。骨粉移植修復(fù)顱骨缺損過程中，少量的間充質(zhì)細(xì)胞和骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成骨細(xì)胞，參與新骨形成，其余全部被吞噬吸收，它的存在除了作為骨引導(dǎo)骨再生強烈的誘導(dǎo)刺激物外，還有三維充填支架的作用。

綜上所述，膜引導(dǎo)下骨粉移植修復(fù)顱骨缺損的過程，滿足了骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)的條件，因此，其實質(zhì)就是膜引導(dǎo)下的骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)再生過程。移植的骨粉是骨引導(dǎo)和骨誘導(dǎo)再生強烈的誘導(dǎo)刺激物，生物膜是該過程得以順利進行的重要保障。

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