PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx與人鼻中隔軟骨細胞的生物相容性研究

常會敏 高天喜 王正輝 盧曉云 吳寶俊 張向紅

PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx與人鼻中隔軟骨細胞的生物相容性研究

常會敏 高天喜 王正輝 盧曉云 吳寶俊 張向紅

目的觀察經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的3-羥基丁酸和3-羥基己酸的共聚酯（PHBHHx）生物材料與人鼻中隔軟骨細胞的生物相容性。方法體外培養(yǎng)人鼻中隔軟骨細胞，接種于經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx膜性材料上進行體外培養(yǎng)，通過MTT比色法、DAPI染色、掃描電鏡、甲苯胺藍染色等實驗方法觀察在體外條件下生物修飾后的PHBHHx膜與鼻中隔軟骨細胞的生物相容性。結果經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx膜表面接觸角變小，親水性增加；人鼻中隔軟骨細胞在蛋白修飾后的生物膜材料表面能保持較高的增殖率；經(jīng)蛋白修飾的PHBHHx膜表面的軟骨細胞活力明顯高于細胞培養(yǎng)板及未經(jīng)蛋白修飾的PHBHHx膜上的軟骨細胞；甲苯氨藍染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)PhaP-RGD修飾的PHBHHx膜能促進軟骨細胞分泌胞外基質(zhì)糖胺多糖。結論經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx與軟骨細胞的生物相容性良好，是一種較理想的軟骨組織工程支架材料。

PhaP-RGD融合蛋白3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯人鼻中隔軟骨細胞組織工程

由于軟骨細胞的自我修復能力有限，因外傷、炎癥或先天畸形造成的耳、鼻、咽喉或氣管部的軟骨損傷修復一直是臨床亟待解決的難題。組織工程學的研究進展為頭頸部缺損軟骨的修復展示了美好的前景。人鼻中隔軟骨細胞屬透明軟骨，較易獲得，且3代以內(nèi)軟骨細胞特性維持良好，適合作為組織工程軟骨修復的種子細胞。3-羥基丁酸與3-羥基己酸共聚酯（PHBHHx）是第三代PHA，是存在于微生物細胞中的一種天然生物材料，由大量微生物在不平衡條件下發(fā)酵產(chǎn)生，具有良好的生物相容性和生物降解性，具備一定的機械強度，有良好的熱可塑性[1]。PhaP是存在于PHA表面的一種PHA顆粒結合蛋白，是一種小分子兩性蛋白質(zhì)。RGD肽被研究證明是能提高細胞與生物材料黏連的有效肽序列[2－3]。實驗證實，利用蛋白工程技術表達純化的PhaP-RGD融合蛋白，對PHBHHx三維支架材料進行生物修飾后，能夠增加材料表面的親水性，促進細胞與材料之間的貼附，并能促進人骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞方向的分化[4]。

本實驗將人鼻中隔軟骨細胞置于經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾后的PHBHHx生物膜上進行體外培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，探討PhaP-RGD融合蛋白對PHBHHx親水性的改變，及其對PHBHHx與軟骨細胞生物相容性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鼻中隔軟骨細胞取自人鼻內(nèi)鏡術后廢棄的軟骨組織。PHBHHx（清華大學陳國教授提供），PHBHHx生物膜由本課題組制作。PhaP-RGD融合蛋白由本課題組進行表達、純化。

1.2 方法

1.2.1 人鼻中隔軟骨細胞的分離培養(yǎng)

取功能性鼻內(nèi)鏡術后廢棄的軟骨（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意），剝除軟骨表面的筋膜，應用“三步消化法”消化；消化停止后經(jīng)篩網(wǎng)過濾后離心去上清，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液，以后每2天換液1次。細胞生長融合達90%后，0.5%胰酶消化，按1∶2進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PhaP-RGD融合蛋白的表達純化

通過重組大腸桿菌BL21（DE3）表達PhaP-RGD融合蛋白，即取含有重組基因PhaP-RGD質(zhì)粒的E. coli BL21(DE3)100μL接種到10 mL LB培養(yǎng)基（氨芐青霉素濃度5 mg/mL）中，恒溫搖床37℃培養(yǎng)12 h；之后加入100μL 24 mg/mL ITPG繼續(xù)培養(yǎng)5 h，誘導菌種表達融合蛋白。驗證融合蛋白的表達后，使用Takara公司的鎳柱純化試劑盒純化目標蛋白，并通過SDS-PAGE和Western blot進行驗證。以不含質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)為對照（不加氨芐和誘導劑）。

1.2.3 PHBHHx膜性材料的制備

利用溶劑揮發(fā)法制備PHBHHx生物膜材料。稱取5 g PHBHHx，溶解于100 mL CHCl3中，蓋上保鮮膜，60℃水浴加熱1 h助溶；將充分溶解的材料均勻鋪至10個9 cm直徑玻璃培養(yǎng)板中；蓋上保鮮膜防止灰塵落入，針頭扎孔使其自然揮發(fā)，24～48 h后可得到PHBHHx膜。

1.2.4 PhaP-RGD融合蛋白的修飾

將PHBHHx膜浸泡在濃度為3.5 mg/mL的PhaP-RGD純化蛋白液中，4℃孵育過夜。用PBS沖洗掉膜表面未結合的蛋白。

1.2.5 接觸角測量PHBHHx膜表面接觸角改變

接觸角測量實驗分為對照組（未處理）和PhaPRGD蛋白處理組。將PHBHHx膜裁剪成小塊，按上述分組并進行相應處理；處理過的膜表面用純水沖洗，測量接觸角之前膜表面的水分用濾紙吸干；將各組膜用雙面膠固定在接觸角測量儀的樣品臺上，在膜表面滴加10μL純水，選擇適當?shù)臏y量區(qū)域測量并拍照。根據(jù)測量數(shù)值計算各組接觸角。

1.2.6 人鼻中隔軟骨細胞種植于PHBHHx膜

未修飾的PHBHHx膜于細胞培養(yǎng)前，以75%乙醇浸泡過夜，紫外照射正反面各1 h，PBS洗3遍。經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白修飾過的PHBHHx膜，經(jīng)PBS洗3遍后用于細胞培養(yǎng)。48孔培養(yǎng)板中，軟骨細胞以2×107cells/cm2的密度接種于兩種PHBHHx膜上，以細胞培養(yǎng)板作為對照，每組3個復孔，37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)3 d和7 d。

1.2.7 細胞增殖與活力的測定

體外培養(yǎng)3 d，4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS漂洗3次；DAPI染色5 min，PBS緩沖液漂洗3次；在洗凈的玻片上滴加2μL的滅菌甘油，使兩種PHBHHx膜固定在玻片上；倒置顯微鏡觀察軟骨細胞在生物膜上的增殖情況。

取培養(yǎng)3 d和7 d的細胞板；每孔加入200μL MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，棄去培養(yǎng)基；將孔板中PHBHHx膜迅速移至新的48孔板內(nèi)，長有細胞的一面朝上；每孔加入200μL DMSO置搖床上震蕩10 min，將每孔中液體加入標記好的96孔板中，每孔150μL，酶標儀測定492 nm波長時的A值，進行細胞活力分析。

1.2.8 甲苯胺藍染色觀察

體外培養(yǎng)7 d后，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定于6孔板中1 h或更長時間（4℃）；自來水洗5 min，蒸餾水洗5 min；加1%甲苯胺藍浸染2 h；去除多余染液，鏡下觀察。

1.2.9 掃描電鏡觀察

體外培養(yǎng)的細胞，經(jīng)過樣本的制備，噴金處理后，在掃描電鏡下觀察其形態(tài)結構。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人鼻中隔軟骨細胞的形態(tài)和生長特性

相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代軟骨細胞呈圓形，折光性較強（圖1-A）；需2 d完成貼壁過程（圖1-B）；第3天細胞出現(xiàn)伸展，開始時為梭形，后呈不規(guī)則三角形或多角形，胞漿中有圓形致密顆粒（圖1-C）。

2.2 表達、純化PhaP-RGD融合蛋白

在驗證目的蛋白正確的基礎上，根據(jù)目標蛋白開頭含His-Tag組氨酸標簽，可以特異性地和鎳吸附的特性，利用鎳柱純化目標蛋白，并對純化的蛋白溶液進行SDS-PAGE電泳和Western blot驗證。結果顯示，經(jīng)過鎳柱純化后，得到了條帶均一的目標融合蛋白溶液（圖2）。

2.3 接觸角測量

PhaP-RGD融合蛋白與膜材料結合后測量其表面水接觸角檢，以檢測其親水性。結果顯示，對照組PHBHHx膜接觸角為98.69°；經(jīng)融合蛋白處理后的PHBHHx膜表面水接觸角為10.63°。表明經(jīng)過融合蛋白的生物修飾作用，材料的表面接觸角明顯變小，證明PhaP-RGD融合蛋白可以增加膜材料表面的親水性（圖3）。

2.4 軟骨細胞在經(jīng)蛋白修飾后PHBHHx膜表面的活力及增殖情況

采用MTT法對生長于經(jīng)PhaP-RGD蛋白修飾PHBHHx膜的軟骨細胞活力進行檢測。結果顯示，在培養(yǎng)3 d后，經(jīng)修飾后的PHBHHx膜表面生長的軟骨細胞活力高于其他兩組。培養(yǎng)7 d后，PHBHHx膜與修飾后PHBHHx膜表面生長的軟骨細胞活力顯著高于細胞培養(yǎng)板內(nèi)的軟骨細胞；而修飾后的PHBHHx膜表面的軟骨細胞活力稍高于PHBHHx膜。表明PHBHHx膜對軟骨細胞沒有細胞毒性，并且會增加細胞的活力；另外，PhaP-RGD融合蛋白能增加PHBHHx膜表面軟骨細胞的活力（圖4）。

采用DPAI法觀察細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)與細胞培養(yǎng)板和未經(jīng)處理的PHBHHx膜相比，經(jīng)過蛋白修飾的PHBHHx膜表面細胞數(shù)目較多（圖5）。

2.5 PHBHHx膜上軟骨細胞形態(tài)特征

掃描電鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，所有膜上的細胞均表現(xiàn)出軟骨細胞的正常形態(tài)（圖6-A1、A3），細胞之間形成連接，開始融合，部分細胞向膜表面的孔隙內(nèi)生長，甚至跨越孔隙（圖6-A2、A4）。

2.6 細胞胞外基質(zhì)分泌情況

甲苯胺藍染色顯示，在沒有接種細胞的膜表面未觀察到異染現(xiàn)象（圖7-A）；在PHBHHx膜及經(jīng)蛋白修飾PHBHHx膜表面均可見藍色異染，經(jīng)蛋白修飾的PHBHHx膜表面較未經(jīng)修飾的PHBHHx染色深（圖7-B、C）。表明經(jīng)PhaP-RGD修飾的PHBHHx膜更能促進軟骨細胞分泌胞外基質(zhì)糖胺多糖。

圖1 原代人鼻中隔軟骨細胞的形態(tài)學觀察（40×）Fig.1 Histological observation of P0 human nasal septal chondrocytes(40×)

圖2 Western blot驗證PhaP-RGD融合蛋白的表達及純化Fig.2 The expression and purification of PhaP-RGD fusion protein

圖3 接觸角測量Fig.3 The measurement of contact angle

圖4 MTT法測定各組軟骨細胞活力（*：P＜0.05）Fig.4 Cell viability of chondrocytes in each group by MTT method(P＜0.05)

圖6 軟骨細胞在PHBHHx膜與修飾后PHBHHx膜表面培養(yǎng)7 d后的掃描電子顯微鏡觀察Fig.6 SEM observation of chondrocytes on PHBHHx film and modified PHBHHx film cultured

圖7 軟骨細胞胞外基質(zhì)的分泌情況Fig.7 The secretion of extracellular matrix of chondrocytes

3 討論

頭頸部軟骨自我修復能力有限，外科手術治療又存在許多缺陷，因此，該區(qū)域軟骨組織缺損的理想修復仍是耳鼻咽喉科面臨的難題之一。近年來，軟骨組織工程研究取得了巨大的進步，為軟骨缺損修復展現(xiàn)出美好的前景。軟骨組織工程的一般策略是將細胞接種于生物材料上，再將這一人工復合體進行移植。理想的用于軟骨移植的支架材料，除了具有無細胞毒性、生物可降解性、有一定的機械強度等組織工程對一般支架材料的要求外，還應該滿足以下要求：促進軟骨細胞的存活、增殖，不影響移植軟骨細胞的活力以及能夠維持軟骨細胞正常表型[5-10]。PHBHHx因較好的生物相容性，在軟骨組織工程的研究中受到重視。但是，作為高分子生物材料，其表面的強疏水性是一直存在的，因此考慮對PHBHHx膜進行表面修飾[11-14]。紫外線、等離子、臭氧等方法常被用于PHBHHx表面改性，主要是通過在材料表面形成所需的官能團，改變表面拓撲結構[15-17]。這些方法或多或少地改變了生物材料原有的性能，限制了生物材料的應用。隨著組織工程的日益發(fā)展，對生物材料的表面修飾提出了更高的要求，特異性識別修飾引起了人們的注意。細胞對生物材料表面的特異性識別，在組織工程中占據(jù)重要的地位，是細胞黏附在生物材料表面并進行增殖、分化等生理活動的基礎，從材料修飾的角度講，在生物材料表面引入能促進細胞特異性識別的分子或基團，無疑是一種修飾的重要途徑[18-19]。眾所周知，RGD肽（細胞黏附信號肽）是提高細胞與生物材料黏連的有效肽序列。有研究將RGD引入PHBV三維支架中[20]，在不干擾原有生物素結合性能的情況下，提高了材料的細胞識別性和生物相容性。另有研究將RGD肽與PHA表面顆粒結合蛋白PhaP融合，用于生物支架材料的修飾，不僅改善了細胞相容性，還促進細胞分化，維持細胞正常形態(tài)[21]。因此，將能結合材料的PhaP蛋白與能促進細胞黏附的RGD序列融合，并對高分子材料進行修飾是改善材料生物相容性的有效方法。

本實驗將PhaP-RGD融合蛋白結合到PHBHHx膜表面，接觸角測量結果顯示經(jīng)PhaP-RGD修飾的PHBHHx接觸角明顯減小，說明PhaP-RGD能夠促進PHBHHx表面的親水性增加。人鼻中隔軟骨細胞種植于PHBHHx膜上后，體外培養(yǎng)3 d，細胞均能黏附于PHBHHx膜上，且修飾后的PHBHHx膜表面的軟骨細胞活力高于PHBHHx膜。說明PHBHHx膜具有良好的細胞親和性，進一步說明了PHBHHx經(jīng)PhaP-RGD修飾后，其疏水性得到較大改善，有利于細胞的黏附生長。7 d后，生長在PHBHHx膜及經(jīng)蛋白修飾PHBHHx膜上的細胞數(shù)量明顯增多，同時細胞周圍可見大量細胞外基質(zhì)，而修飾后的PHBHHx膜表面的軟骨細胞細胞外基質(zhì)分泌更多。說明PhaP-RGD能夠促進細胞的增殖，且軟骨細胞的特性維持良好。

本實驗結果表明，經(jīng)PhaP-RGD融合蛋白生物修飾的PHBHHx作為人鼻中隔軟骨細胞移植的支架材料，不僅可以為移植的軟骨細胞提供物理支撐，維持細胞正常表型，還使生長在其表面的軟骨細胞表現(xiàn)出更好的細胞活力。這為生物修飾后的PHBHHx作為軟骨細胞移植的支架材料提供了有力證據(jù)，有望進一步用于體內(nèi)組織工程軟骨修復的研究。

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Biocompatibility of Human Nasal Septal Chondrocytes on PHBHHx Coated with PhaP-RGD Fusion Peptide

CHANG Huimin1,GAO Tianxi2,WANG Zhenghui2,LU Xiaoyun3,WU Baojun2,ZHANG Xianghong2.1 Department of Otolaryngology,Affiliated Hospital of Xi'an Medical University,Xi'an 710077,China;2 Department of Otolaryngology& Head and Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China;3 Xi'an Jiaotong University School of Life Science&Technology,Xi'an 710049,China.Corresponding author:WANG Zhenghui(E-mail: ehui4298@163.com).

ObjectiveTo explore the biocompatibility of PHBHHx biomaterial coated with PhaP-RGD fusion protein on human nasal septal chondrocytes.MethodsThe human nasal septal chondrocytes were cultured and seeded onto the PHBHHx biomaterials modified with PhaP-RGD fusion protein in vitro.The biocompatibility of modified PHBHHx on human nasal septal chondrocytes was detected by MTT assay,DAPI staining,scanning electron microscopy and toluidine blue staining.ResultsThe contact angle of modified PHBHHx was smaller and the surface hydrophilicity increased;The human nasal septal chondrocytes on modified maintained a high proliferation rate.The viability of chondrocytes on modified PHBHHx film was significantly higher than that on PHBHHx film and cell culture plate.It is discovered that PHBHHx film coated with PhaP-RGD can promote the secretion of extracellular matrix of cartilage--glycosaminoglycan by toluidine blue staining.ConclusionPHBHHx coated with PhaP-RGD fusion protein has better biocompatibility on chondrocytes,and is an ideal scaffold material for cartilage tissue engineering.

PhaP-RGD fusion protein;Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate); Human nasal septal chondrocytes;Tissue-engineered cartilage

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）06－0319－05

2013年9月16日；

2013年11月5日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.06.005

國家自然科學基金資助項目（81000416）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金（西安交通大學國際合作類，交叉學科類）；西安交通大學第二附屬醫(yī)院人才培養(yǎng)基金[RC(XM)201102]；西安交通大學第二附屬醫(yī)院重點項目基金[YJ(ZD)201103]。

710077陜西省西安市西安醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻喉科（常會敏）；710004陜西省西安市西安交通大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（高天喜，王正輝，吳寶俊，張向紅）；710049陜西省西安市西安交通大學生命科學與技術學院（盧曉云）。

王正輝（E-mail：ehui4298@163.com）。