直鏈烷基苯磺酸鈉對(duì)小鼠精子成熟和生育能力的影響

竇曉衛(wèi)，任春娥，柏宏偉，劉洪香，張安清

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261042)

精子成熟是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在睪丸內(nèi)生成的精子沒(méi)有良好的活動(dòng)能力。在從睪丸向附睪的輸送過(guò)程中逐漸完成形態(tài)和功能的轉(zhuǎn)變，因此附睪是促進(jìn)精子成熟、儲(chǔ)存的重要器官［1］。直鏈烷基苯磺酸鈉(linear alkylbenzene sulphonates，LAS)是合成洗滌劑的表面活性物質(zhì)，其對(duì)睪丸結(jié)構(gòu)和生殖能力的影響已有相關(guān)報(bào)道［2］，而亞慢性或慢性LAS染毒對(duì)哺乳動(dòng)物生殖能力的影響卻鮮有報(bào)道，尤其是對(duì)精子成熟過(guò)程及相關(guān)作用機(jī)制的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用昆明雄系小鼠作為動(dòng)物模型，觀察附睪頭和附睪尾精子的功能參數(shù)，結(jié)合與正常雌鼠交配后所生子代的情況，評(píng)價(jià)直鏈烷基苯磺酸鈉對(duì)小鼠精子成熟和生育能力的影響，為研究LAS 的生殖毒性機(jī)制提供相應(yīng)的參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS，C18，有效含量不低于95%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，伊紅染液、蘇木素染液、二甲苯、中性樹(shù)膠等，WLJY 精子分析系統(tǒng)，YD－AB 型生物組織攤烤片機(jī)，BX41TF 光學(xué)顯微鏡，H－7500透射電鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及染毒模型的建立 健康雄性昆明小鼠60 只，鼠齡4 周，體重29～34 g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組A (LAS 630 mg/kg)，實(shí)驗(yàn)組B (LAS 315 mg/kg)，對(duì)照組C (生理鹽水)，每組20 只。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)口攝入直鏈烷基苯磺酸鈉，每日1 次，連續(xù)染毒60 天，各組小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，光照10 h/d，自由飲食和飲水。雌鼠30 只，6～8 周齡，體重20～25 g，常規(guī)飼養(yǎng)1 周，用于與雄鼠的交配。

1.3 小鼠附睪精子參數(shù)的檢測(cè) 染毒60 天時(shí)，頸椎脫臼法處死小鼠，每組處死10 只，迅速解剖取附睪頭和附睪尾，分別置于1 mL 的生理鹽水中(37℃預(yù)熱)，孵育1 分鐘后，常規(guī)精液涂片，光學(xué)顯微鏡下至少觀察100 個(gè)精子，計(jì)數(shù)精子密度、活力及胞漿小滴率。應(yīng)用改良的巴氏染色法進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析，計(jì)數(shù)精子畸形率，觀察精子畸形的種類(lèi)。

1.4 小鼠附睪尾精子的透射電鏡觀察 常規(guī)方法制備小鼠附睪尾精子的透射電鏡切片［3］，觀察精子的超微結(jié)構(gòu)。

1.5 小鼠的生殖能力試驗(yàn) 經(jīng)各組中未處死的雄鼠(n=10)，分別與正常雌鼠交配，雌雄比例為1∶1，自合籠后起每日觀察雌鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓為懷孕的第1 天，計(jì)數(shù)孕鼠的比例，孕鼠常規(guī)飼養(yǎng)18 天后解剖，觀察胎鼠的情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得結(jié)果采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較進(jìn)行單因素方差分析及q 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LAS 對(duì)小鼠附睪頭和附睪尾精子各項(xiàng)功能參數(shù)的影響 對(duì)照組小鼠附睪尾精子多表現(xiàn)為快速向前運(yùn)動(dòng)，附睪頭精子運(yùn)動(dòng)相對(duì)微弱，多為原位擺動(dòng)或緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)。和對(duì)照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪頭和附睪尾精子密度、活力均顯著降低(P ＜0.001，P ＜0.05)，精子畸形率顯著升高(P ＜0.001)，且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(見(jiàn)表1－3)。對(duì)照組小鼠中附睪頭精子含胞漿小滴率為70.5%，附睪尾精子為29.9%;低劑量染毒組小鼠胞漿小滴率從附睪頭的72.7%降至附睪尾精子的41.6%，即有31.1%的胞漿小滴脫落;而精子胞漿小滴脫落的異常在高劑量染毒組小鼠中則變現(xiàn)的更為顯著，從附睪頭精子的79.8% 降到附睪尾精子的61.6%，即僅有18.2%的胞漿小滴脫落。見(jiàn)圖1。

表1 LAS 對(duì)小鼠附睪頭和附睪尾精子密度的影響(n=10，，×106/mL)

表2 LAS 對(duì)小鼠附睪頭和附睪尾精子活力的影響(n=10，，%)

表3 LAS 對(duì)小鼠畸形精子率的影響(n=10，，%)

2.2 LAS 對(duì)小鼠精子形態(tài)學(xué)的改變 光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組小鼠精子頭部呈鐮刀狀，尾部細(xì)長(zhǎng)，附睪頭精子和附睪尾精子最明顯的形態(tài)學(xué)差異在于胞漿小滴，附睪頭精子含胞漿小滴者多，且多位于尾部頸段，使精子尾部明顯彎曲。實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪尾精子的胞漿小滴率明顯增加，且有多種頭部和尾部畸形，如雙頭、香蕉頭、斷尾等。透射電鏡下，對(duì)照組小鼠精子9 +2 結(jié)構(gòu)清晰，尾部線(xiàn)粒體排列緊密，大小形態(tài)一致。實(shí)驗(yàn)組小鼠精子的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為尾部線(xiàn)粒體排列疏松、腫脹、空泡形成等一系列凋亡前征象，并具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.3 LAS 對(duì)小鼠生育能力的影響 經(jīng)LAS 染毒后，低劑量組和高劑量組小鼠的生育能力均呈不同程度的下降，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且呈現(xiàn)出效量效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組孕鼠腹中死胎+吸收胎鼠比例明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)。

表4 LAS 對(duì)小鼠生殖能力的影響

3 討 論

附睪作為雄性哺乳動(dòng)物的附屬性腺，是精子成熟、保護(hù)、運(yùn)輸、貯存的重要部位。附睪上皮細(xì)胞的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能使精子發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而使精子獲得受精和運(yùn)動(dòng)能力［4］。本實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)LAS 染毒后的小鼠精子活力顯著降低，提示小鼠的附睪功能受到不同程度的損害，使小鼠精子的運(yùn)動(dòng)能力下降。

精子在附睪中的成熟要經(jīng)歷非常復(fù)雜的過(guò)程，其中最主要的變化時(shí)精子尾部的胞漿小滴和尾部的卷曲。正常情況下，伴隨著精子從附睪頭向附睪尾的移行過(guò)程中，胞漿小滴同時(shí)向尾部末端移動(dòng)，至精子成熟時(shí)，胞漿小滴隨之消失［5］。在附睪頭部，精子尾部呈卷曲狀，隨著精子的轉(zhuǎn)運(yùn)，尾部卷曲的精子數(shù)目逐漸下降，至附睪尾部時(shí)精子尾部變直。研究表明精子胞漿小滴貯留和附睪功能改變、生育力下降等有關(guān)［6］，主要原因是胞漿小滴貯留后改變了精子胞膜脂質(zhì)組成和代謝而使精子破裂增加［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明直鏈烷基苯磺酸鈉可以增加附睪尾部胞漿小滴的殘留率。另外，透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠多見(jiàn)精子核空泡、頂體腫脹和線(xiàn)粒體排列紊亂等超微結(jié)構(gòu)的變化，說(shuō)明精子在附睪階段發(fā)生了降解性改變，可見(jiàn)LAS 導(dǎo)致精子的附睪成熟降低。

哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程是從受精開(kāi)始的，而受精能力的獲得是在附睪中完成的，本實(shí)驗(yàn)中觀察到二個(gè)染毒劑量組小鼠仍然保持生育能力，但較對(duì)照組顯著下降，同樣可作為附睪功能減退的證據(jù)。直鏈烷基苯磺酸鈉屬于低毒化學(xué)物質(zhì)，但其應(yīng)用廣泛并缺乏最低安全劑量標(biāo)準(zhǔn)［8］。近年來(lái)，LAS 的生殖毒性已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，研究表明LAS 可使生物體內(nèi)抗氧化酶活性降低，誘發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而干擾細(xì)胞內(nèi)的各種代謝活動(dòng)，影響細(xì)胞的增值和分化［9］?，F(xiàn)今為止，在已婚夫婦當(dāng)中，大于15%的夫婦正受著不孕癥的困擾，其中大于50%是由于男性因素引起［10－11］，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示LAS 的廣泛使用可能會(huì)造成潛在的生殖健康危害。包括LAS 等在內(nèi)的家用化學(xué)物品，在為人類(lèi)帶來(lái)方便和潔凈的同時(shí)，造成了潛在的健康危害，構(gòu)成了社會(huì)衛(wèi)生和安全問(wèn)題。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)LAS 毒性作用機(jī)制的研究，為確定最低安全接觸量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本實(shí)驗(yàn)以LAS 染毒小鼠作為研究模型，以附睪內(nèi)精子的各項(xiàng)功能指標(biāo)作為研究?jī)?nèi)容，可見(jiàn)LAS 影響了小鼠的附睪成熟過(guò)程，并為尋找LAS毒性作用的睪丸后靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。給予2 個(gè)不同劑量的LAS，高劑量組小鼠所受的影響最為顯著，此結(jié)果對(duì)男性生殖健康是有參考意義的。

圖2 正常精細(xì)形態(tài) HE×400

圖3 胞漿小滴陽(yáng)性精子形態(tài) HE×400

圖4 正常精子尾部結(jié)構(gòu)(EM，×20000)，線(xiàn)粒體排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰無(wú)空泡化現(xiàn)象

圖5 實(shí)驗(yàn)組小鼠精子結(jié)構(gòu)(EM，×20000)，胞漿內(nèi)大量空泡形成，精子9 +2 結(jié)構(gòu)不完整，線(xiàn)粒體數(shù)目減少，排列疏松

［1］Cornwall GA.New insights into epididymal biology and function［J］.Hum Reprod Update，2009，15 (2):213－227.

［2］莫少耀，李少群，麥惠霞，等.直連烷基笨磺酸鈉對(duì)雄性大鼠生殖細(xì)胞的毒性研究［J］.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，1993，S1:38－42.

［3］朱偉杰，梁蔚波，金慶騮.人類(lèi)睪丸精子和附睪精子的頂體蛋白酶活性［J］.中國(guó)病理生理雜志，1998，14 (5):465－468.

［4］Dacheux JL，Gatti JL，Dacheux F.Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation ［J］.Microsc Res Teeh，2003，61 (1):7－17.

［5］Matousek J，Kysilka C.The phospholipid－binding protein of the reproductive tract of the bull－effect on the removal of spermatozoal cytoplasm droplets in other species and influence of antibodies on its reactivity ［J］.Anim Reprod Sci，1984，7:433－440.

［6］劉杰，李建遠(yuǎn)，王海燕，等.精子胞漿小滴的發(fā)現(xiàn)及其研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，11 (5):976－977.

［7］Ralf Henkel，Gesa Maa.Sperm function and assisted reproduction technology ［J］.Reproductive Medicine and Biology，2005，4:7－30.

［8］張萍，梁島道.環(huán)境激素對(duì)人類(lèi)健康的危害及監(jiān)測(cè)方法［J］.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，16 (6):63－65.

［9］蔡德雷，徐立紅，于曉峰，等.餐具洗潔精對(duì)小鼠肝臟解毒功能的影響［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2004，21 (4):267－269.

［10］Seshagiri PB.Molecular insights into the causes of male infertility ［J］.J Biosci，2001，26:429－435.

［11］趙文紅，張鼎，周純先，等.直鏈烷基苯磺酸鈉對(duì)果腹果蠅生育能力及壽命的影響［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36(2):154－158.