組織工程化同種異體椎間盤(pán)移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

辛洪奎，張 超，王德利，吳劍宏，王超峰，何 勍，阮狄克

椎間盤(pán)退行性疾病是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響患者日常工作及生活。傳統(tǒng)治療手段存在一定不足，同種異體椎間盤(pán)移植是目前正在嘗試的探索性治療手段。但臨床研究證實(shí)異體椎間盤(pán)移植后會(huì)出現(xiàn)不同程度的退行性改變，這將影響椎間盤(pán)移植的遠(yuǎn)期臨床效果。如能通過(guò)合適的技術(shù)手段延緩移植椎間盤(pán)的退行性改變，將有可能使椎間盤(pán)退變性疾病的治療達(dá)到更好的療效。

本研究借鑒組織工程的理念來(lái)審視同種異體椎間盤(pán)移植，將同種異體椎間盤(pán)視作椎間盤(pán)組織工程的天然支架材料，并以組織工程的技術(shù)手段來(lái)優(yōu)化同種異體椎間盤(pán)的生物活性，通過(guò)復(fù)合具有生物活性的種子細(xì)胞使之組織工程化。在體外成功構(gòu)建組織工程化異體椎間盤(pán)的基礎(chǔ)上，擬通過(guò)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞干預(yù)技術(shù)是否可有效延緩?fù)N異體椎間盤(pán)移植后的退行性改變。

1 材料與方法

1.1 同種異體椎間盤(pán)的收集與冷凍保存

1 歲齡比格犬3 只，麻醉后處死，無(wú)菌切取胸段及腰段脊柱。自終板上下兩側(cè)鋸斷椎體，保留約3 mm終板下骨。標(biāo)本取出后置于50 mL 離心管，加入含10%FBS 和DMSO 的DMEM/F12(1∶1)的培養(yǎng)基后逐級(jí)冷凍:4℃過(guò)夜，-20℃放置2 h，-40℃放置2 h，-80℃放置2 h，液氮保存。

1.2 犬髓核細(xì)胞的體外培養(yǎng)

8 周齡幼犬，麻醉處死后無(wú)菌切取脊柱，水平切開(kāi)椎間盤(pán)，刮取膠凍狀髓核置于15 mL 離心管中，2 g/L 膠原酶(Gibco，美國(guó))消化2 h 后1 000 r/mim離心5 min，PBS 沖洗2 次，收集細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清(Gibco)F12 培養(yǎng)基(Gibco)，37℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3 同種異體椎間盤(pán)的體外組織工程化

傳2 代髓核細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到單層融合后，胰酶消化后PKH-26 標(biāo)記，制備成5 ×106/mL 細(xì)胞懸液。使用16G 注射針頭的1 mL 注射器吸入細(xì)胞懸液備用。將12 個(gè)椎間盤(pán)隨機(jī)分為2 組，實(shí)驗(yàn)組注入5 ×106/mL 細(xì)胞懸液25 μL(A 組);對(duì)照組注射入等量生理鹽水并體外培養(yǎng)(B 組)。將構(gòu)建完成的細(xì)胞-同種異體椎間盤(pán)支架復(fù)合體置于50 mL 離心管，加入15 mL 含10%胎牛血清F12 培養(yǎng)基，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

1.4 組織工程化同種異體椎間盤(pán)比格犬原位移植手術(shù)

12 月齡比格犬12 只分為2 組，分別植入2 組同種異體椎間盤(pán)，目標(biāo)間隙為L(zhǎng)4/L5。肌肉注射全身麻醉后常規(guī)消毒，鋪無(wú)菌單。沿肋弓下緣自后上斜向前下切開(kāi)皮膚及皮下組織，切口長(zhǎng)約8 cm。分離腹膜并向前方牽開(kāi)。將腰大肌牽向后方，顯露腰椎椎體及椎間盤(pán)。Caspar 撐開(kāi)器撐開(kāi)椎間隙，切除椎間盤(pán)，刮除上下軟骨終板，將修整好的同種異體椎間盤(pán)植入L4/L5間隙。逐層縫合切口，術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素160 萬(wàn)單位預(yù)防感染。

1.5 移植椎間盤(pán)轉(zhuǎn)歸的影像學(xué)觀察分析

術(shù)后即刻及4、8、12 周行正側(cè)位X 線及MRI 檢查，觀察各組移植椎間盤(pán)同宿主椎體愈合情況、移植椎間盤(pán)形態(tài)、高度保持情況。根據(jù)X 線檢查結(jié)果測(cè)量椎間盤(pán)高度變化，椎間隙高度取椎間隙前、中、后部高度的平均值;根據(jù)MRI 檢查結(jié)果測(cè)量椎間盤(pán)T2相信號(hào)強(qiáng)度。使用Photoshop version 7.0(Adobe，San Jose，CA，USA)圖像處理軟件測(cè)量MRI T2 加權(quán)像中手術(shù)節(jié)段髓核的灰度值，并與同節(jié)段椎管內(nèi)腦脊液的灰度值進(jìn)行比較，得出手術(shù)節(jié)段髓核的比灰度值，用以判斷髓核的含水量，每項(xiàng)測(cè)量均由有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)師測(cè)量3 次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 生物力學(xué)分析

手術(shù)后12 周麻醉狀態(tài)下處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取L1～7段脊柱標(biāo)本，骨水泥包埋。將標(biāo)本連接到生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)MTS 858 Mini BionixⅡ，加載1.0 N·M 的扭矩觸發(fā)標(biāo)本左右旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，測(cè)量L4，5椎體的相對(duì)位移動(dòng)度;使用三維運(yùn)動(dòng)加載系統(tǒng)加載3.0 N·M 的扭矩觸發(fā)標(biāo)本進(jìn)行屈伸及左右側(cè)曲運(yùn)動(dòng)，測(cè)量L4，5椎體的相對(duì)位移動(dòng)度。各向運(yùn)動(dòng)均測(cè)量5 次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。

1.7 組織學(xué)觀察

線鋸將L4/L5椎間盤(pán)從脊柱標(biāo)本中取出，保留L4下終板及L5上終板，每組各取2 個(gè)椎間盤(pán)行冰凍切片后激光共聚焦顯微鏡觀察PKH-26 標(biāo)記細(xì)胞。其余椎間盤(pán)標(biāo)本福爾馬林固定24 h，脫鈣液脫鈣2 周后石蠟包埋，常規(guī)切片HE 染色，顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 犬髓核細(xì)胞的分離培養(yǎng)及熒光標(biāo)記

幼犬髓核呈半透明膠凍狀。髓核細(xì)胞接種48 h即可貼壁伸展。鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)豐富，胞體飽滿，呈短梭形。隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞極性逐漸增強(qiáng)，呈長(zhǎng)梭形，似成纖維細(xì)胞，生長(zhǎng)變緩。使用PKH-26 標(biāo)記細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)髓核細(xì)胞膜呈現(xiàn)出均勻的紅色熒光，細(xì)胞-同種異體椎間盤(pán)復(fù)合體植入體內(nèi)后12 周可于椎間盤(pán)內(nèi)部觀察到紅色熒光細(xì)胞(見(jiàn)圖1)。

2.2 動(dòng)物手術(shù)

所有動(dòng)物手術(shù)均順利完成(見(jiàn)圖2)。平均手術(shù)時(shí)間65 min，出血量為40 mL。所有實(shí)驗(yàn)犬切口愈合良好。

2.3 X 線檢查

圖1 傳2 代犬髓核細(xì)胞Fig.1 Second passage of nucleus pulposus cells

圖2 手術(shù)操作Fig.2 Operative procedure

X 線檢查結(jié)果顯示移植椎間盤(pán)與宿主椎體均實(shí)現(xiàn)了良好的骨性融合。B 組4 周即出現(xiàn)了椎體前緣骨贅形成、椎間隙狹窄等退行性改變，且在第8 周及第12 周表現(xiàn)出進(jìn)展趨勢(shì)。A 組在各觀察點(diǎn)未出現(xiàn)上述典型退行性改變(見(jiàn)圖3)。術(shù)后2 組動(dòng)物椎間隙高度均呈下行趨勢(shì)，B 組下降幅度較為明顯，至移植后8 周其高度已明顯低于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)圖4)。

2.4 MRI 觀察分析

MRI 觀察結(jié)果顯示移植后2 組椎間盤(pán)均呈現(xiàn)不同程度的退行性改變，B 組尤為明顯。12 周時(shí)，其移植椎間盤(pán)術(shù)前典型的髓核結(jié)構(gòu)形態(tài)及信號(hào)特點(diǎn)消失不見(jiàn)，髓核信號(hào)顯著降低，呈典型的“黑間盤(pán)”樣改變;A 組動(dòng)物移植椎間盤(pán)雖然髓核信號(hào)有部分降低，但仍較好的保持了髓核的形態(tài)結(jié)構(gòu)及T2 像高信號(hào)的影像學(xué)特點(diǎn)(見(jiàn)圖5)。對(duì)髓核T2信號(hào)比灰度值的動(dòng)態(tài)對(duì)比表明，術(shù)后2 組椎間盤(pán)信號(hào)比灰度值均呈下行趨勢(shì)。術(shù)后4 周，B 組髓核T2 信號(hào)比灰度值已明顯低于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)圖6)。

圖3 術(shù)后12 周移植椎間盤(pán)側(cè)位X 線片F(xiàn)ig.3 Lateral roentgenograph of intervertebral disc at 12 weeks after implantation

2.5 生物力學(xué)分析

生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示2 組移植椎間盤(pán)在左右側(cè)曲活動(dòng)度上無(wú)明顯區(qū)別。而對(duì)于屈伸及旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定性的保持，A 組于術(shù)后12 周明顯優(yōu)于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)圖7)。

2.6 組織學(xué)觀察

對(duì)移植椎間盤(pán)行切片后HE 染色組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)A 組移植椎間盤(pán)結(jié)構(gòu)保持較好，外形類(lèi)似軟骨細(xì)胞的髓核細(xì)胞，數(shù)量較多，排列較為規(guī)則;而B(niǎo) 組髓核形態(tài)保持欠佳，結(jié)構(gòu)較為紊亂，髓核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)欠飽滿，退行性改變明顯(見(jiàn)圖8)。

3 討 論

圖4 術(shù)后2 組移植椎間盤(pán)高度比較圖5 術(shù)后12 周移植椎間盤(pán)MRI圖6 術(shù)后2 組移植椎間盤(pán)髓核信號(hào)比灰度值比較圖7 2 組間不同方向活動(dòng)度的生物力學(xué)比較Fig.4 Compare of intervertebral disc height in 2 groups after implantationFig.5 MRI of intervertebral disc at 12 weeks after implantationFig.6 Compare of nucleus gelatinosus signal ratio of gray value in 2 groups after implantationFig.7 Biomechanics compare of range of motion in 2 groups at different direction

圖8 組織學(xué)觀察Fig.8 Histology observation

本研究小組于2007 年報(bào)道了同種異體椎間盤(pán)移植治療頸椎椎間盤(pán)退行性疾病的臨床研究，5 年隨訪的結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的椎間盤(pán)可以存活并且部分保留移植節(jié)段的穩(wěn)定性以及活動(dòng)度［1］。研究結(jié)果表明同種異體椎間盤(pán)移植的確有望成為修復(fù)椎間盤(pán)退變的方法之一。隨訪中觀察到移植椎間盤(pán)含水量下降以及高度降低等退行性改變，這些退行性改變的進(jìn)展有可能再次導(dǎo)致神經(jīng)壓迫以及繼發(fā)性椎管狹窄等病理改變，從而影響椎間盤(pán)移植的遠(yuǎn)期臨床效果。因此，如何延緩椎間盤(pán)移植后的退變是本研究要探索的內(nèi)容。從椎間盤(pán)組織工程的研究中受到啟發(fā)［2］，本研究擬將組織工程技術(shù)應(yīng)用于同種異體椎間盤(pán)移植，將其視為天然椎間盤(pán)組織工程支架材料，通過(guò)與髓核細(xì)胞的復(fù)合以期達(dá)到增強(qiáng)異體椎間盤(pán)活性、實(shí)現(xiàn)延緩移植后退變的目的。椎間盤(pán)內(nèi)的高應(yīng)力作用和營(yíng)養(yǎng)缺乏對(duì)種子細(xì)胞的存活、增值及功能發(fā)揮提出嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。移植后12 周本研究A 組髓核區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了PKH-26 陽(yáng)性細(xì)胞的大量存在，這為種子細(xì)胞的存活提供了直接的證據(jù)。成年后椎間盤(pán)組織無(wú)血供來(lái)源，營(yíng)養(yǎng)供給主要依靠上下軟骨終板中的微孔來(lái)維持［3-4］，本研究認(rèn)為在體內(nèi)條件下，髓核內(nèi)種子細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給通過(guò)微孔的滲透效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中保留近2 mm 的終板下骨，可以保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)終板下骨達(dá)到終板并完成滲透效應(yīng)。椎間盤(pán)組織內(nèi)環(huán)境的特點(diǎn)為低氧高張力，在這種內(nèi)環(huán)境下，細(xì)胞代謝活動(dòng)相對(duì)緩慢，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較少，滲透效應(yīng)可以保證種子細(xì)胞的正常代謝。

組織工程技術(shù)具有2 大核心要素，即種子細(xì)胞與支架材料。對(duì)于種子細(xì)胞的選擇，最新醫(yī)學(xué)研究成果表明髓核細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞等均具有修復(fù)椎間盤(pán)退行性改變的潛力［5-8］，諸多可供選擇的細(xì)胞來(lái)源讓人目不暇接。本研究認(rèn)為在現(xiàn)有技術(shù)手段條件下，任何非髓核細(xì)胞來(lái)源的種子細(xì)胞均無(wú)法完整模擬髓核細(xì)胞的代謝特點(diǎn)及功能表達(dá)。這是本研究選擇髓核細(xì)胞作為種子細(xì)胞原因所在。髓核細(xì)胞所表達(dá)的Ⅱ型膠原及蛋白多糖成分正是延緩椎間盤(pán)退變所必需的重要細(xì)胞外基質(zhì)成分，并且髓核細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)其表達(dá)量及二者之間的比例同天然椎間盤(pán)接近。實(shí)驗(yàn)中觀察到復(fù)合至異體椎間盤(pán)內(nèi)的髓核細(xì)胞不但可在體內(nèi)存活，并且可以有效地保持移植椎間盤(pán)的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，同時(shí)維持手術(shù)節(jié)段的高度及穩(wěn)定性，這表明髓核細(xì)胞的確具有良好的抗退變效應(yīng)。此外，在組織學(xué)觀察中2 組椎間盤(pán)內(nèi)均未見(jiàn)到明顯的免疫反應(yīng)及炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，這也間接證明了髓核組織的免疫豁免性［9］。

本研究的主要目的是通過(guò)比格犬腰椎原位植入實(shí)驗(yàn)探討髓核細(xì)胞的介入是否可以實(shí)現(xiàn)延緩移植后同種異體椎間盤(pán)的退變進(jìn)程。X 線及MRI 檢查結(jié)果顯示術(shù)后通過(guò)細(xì)胞干預(yù)手段有效地保持了移植椎間盤(pán)的高度以及移植椎間盤(pán)髓核的形態(tài)及信號(hào)強(qiáng)度;生物力學(xué)分析證實(shí)細(xì)胞干預(yù)在保持脊柱功能單元穩(wěn)定性方面具有明顯優(yōu)勢(shì);同時(shí)，組織學(xué)發(fā)現(xiàn)復(fù)合了種子細(xì)胞的異體椎間盤(pán)移植后其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及髓核細(xì)胞表型得到了更好地保持。上述研究結(jié)果證明髓核細(xì)胞干預(yù)可以有效延緩?fù)N異體椎間盤(pán)移植后的退行性改變。

雖然本研究結(jié)果提示髓核細(xì)胞植入椎間盤(pán)內(nèi)的確可以起到延緩?fù)俗兊男Ч?，但在移植后的?dòng)態(tài)觀察中同樣發(fā)現(xiàn)了復(fù)合了髓核細(xì)胞的異體椎間盤(pán)存在著一定程度的退行性改變，表現(xiàn)為椎間盤(pán)高度的輕微降低以及髓核含水量的小幅下降。究其原因，可能是由髓核細(xì)胞增殖能力的有限性及其體外培養(yǎng)的去分化現(xiàn)象［10-11］所決定的。這一定程度上限制了髓核細(xì)胞在這一領(lǐng)域的應(yīng)用前景，但其天然髓核細(xì)胞表型的固有優(yōu)越性是其他細(xì)胞來(lái)源，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞，無(wú)法比擬的，如能通過(guò)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)手段促進(jìn)髓核細(xì)胞的活性及其增殖能力，將極大拓展其在椎間盤(pán)退變生物治療中的作用空間。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比格犬體內(nèi)原位植入觀察異體椎間盤(pán)體內(nèi)植入轉(zhuǎn)歸及髓核細(xì)胞的抗退變效應(yīng)。結(jié)果表明異體椎間盤(pán)移植后可與宿主椎體良好愈合，種子細(xì)胞可存活并有效保持椎間盤(pán)高度、髓核含水量，維持了脊柱節(jié)段的穩(wěn)定性及生理活動(dòng)功能。本研究提示組織工程技術(shù)的運(yùn)用可以有效延緩?fù)N異體椎間盤(pán)移植后的退行性改變。

［1］Ruan D，He Q，Ding Y，et al.Intervertebral disc transplantation in the treatment of degenerative spine disease:a preliminary study［J］.Lancet，2007，369(9566):993-999.

［2］Ruan DK，Xin H，Zhang C，et al.Experimental intervertebral disc regeneration with tissue-engineered composite in a canine model［J］.Tissue Eng Part A，2010，16(7):2381-2389.

［3］Rodriguez AG，Rodriguez-Soto AE，Burghardt AJ，et al.Morphology of the human vertebral endplate［J］.J Orthop Res，2012，30(2):280-287.

［4］Grunhagen T，Shirazi-Adl A，F(xiàn)airbank JC，et al.Intervertebral disk nutrition:a review of factors influencing concentrations of nutrients and metabolites［J］.Orthop Clin North Am，2011，42(4):465-477.

［5］Orozco L，Soler R，Morera C，et al.Intervertebral disc repair by autologous mesenchymal bone marrow cells:a pilot study［J］.Transplantation，2011，92(7):822-828.

［6］Gruber HE，Deepe R，Hoelscher GL，et al.Human adiposederived mesenchymal stem cells:direction to a phenotype sharing similarities with the disc，gene expression profiling，and coculture with human annulus cells［J］.Tissue Eng Part A，2010，16(9):2843-2860.

［7］Smith LJ，Chiaro JA，Nerurkar NL，et al.Nucleus pulposus cells synthesize a functional extracellular matrix and respond to inflammatory cytokine challenge following long-term agarose culture［J］.Eur Cell Mater，2011，22:291-301.

［8］Meisel HJ，Siodla V，Ganey T，et al.Clinical experience in cellbased therapeutics:disc chondrocyte transplantation A treatment for degenerated or damaged intervertebral disc［J］.Biomol Eng，2007，24(1):5-21.

［9］Nomura T，Mochida J，Okuma M，et al.Nucleus pulposus allograft retards intervertebral disc degeneration［J］.Clin Orthop，2001(389):94-101.

［10］Kluba T，Niemeyer T，Gaissmaier C，et al.Human anulus fibrosis and nucleus pulposus cells of the intervertebral disc:effect of degeneration and culture system on cell phenotype［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2005，30(24):2743-2748.

［11］Hu MH，Hung LW，Yang SH，et al.Lovastatin promotes redifferentiation of human nucleus pulposus cells during expansion in monolayer culture［J］.Artif Organs，2011，35(4):411-416.