多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的β內(nèi)酰胺酶基因型研究

歐陽英娥 湯鳳珍 陳廣新 胡英華

（廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院，廣東 廣州510800）

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的β內(nèi)酰胺酶基因型研究

歐陽英娥 湯鳳珍 陳廣新 胡英華

（廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院，廣東 廣州510800）

目的 了解臨床分離的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌 β 內(nèi)酰胺酶基因的存在情況。方法 采用 MicroScan40 微生物全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)微量肉湯稀釋法測(cè)定菌株的耐藥性。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測(cè) β-內(nèi)酰胺酶基因型。結(jié)果 30 株鮑曼不動(dòng)桿菌除對(duì)阿米卡星和左氧氟沙星耐藥率分別為 23.3% 和 30.0% 外，對(duì)其他抗菌藥物均達(dá) 80.0% 以上。檢出 β-內(nèi)酰胺酶基因 26 株（86.7%），OXA-23 樣陽性 20 株（66.7%），OXA-51 樣陽性 18 株（60.0%），AMPC 酶陽性 18 株（60.0%），TEM 陽性 5 株 (16.6%)，SHV 陽性 4 株（13.3%），PER 陽性 3 株（10%），14 株（46.6%）同時(shí)攜帶 2 種以上基因，未檢出 IMP、VIM、CTX-M-9，DHA、OXA-24、OXA-58。結(jié)論 我院多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶多種 β-內(nèi)酰胺酶基因，而且同時(shí)攜帶 3種以上 β-內(nèi)酰胺酶基因比率高。

鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥；耐藥基因

鮑曼不動(dòng)桿菌（ABA）是醫(yī)院感染常見的病原菌之一，也是目前能夠引起醫(yī)院內(nèi)感染的一種重要的病原菌。近年來其從臨床標(biāo)本中分離率不斷增加，在非發(fā)酵菌中分離率僅次于銅綠假單胞菌，居第2位。隨著抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥鮑曼的不動(dòng)桿菌比例也在不斷地上升[1]。為了解我院多重耐藥ABA菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制，現(xiàn)在采用聚合酶鏈的反應(yīng)方法對(duì)臨床上分離的多重耐藥30多株ABA菌株檢測(cè)其相關(guān)β-內(nèi)酰胺酶的基因型，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

自2008年09月到2010年10月對(duì)我院患者的臨床標(biāo)本分離進(jìn)行收集的銅綠假單胞菌進(jìn)行篩選，一共篩選出32株多重耐藥菌株。多重耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)主要是3類或者以上的抗菌藥物的耐藥菌株，其中中段尿占2株、痰液占28株，以及傷口分泌物占2株，病區(qū)主要是來源于神經(jīng)外科ICU和中心ICU。質(zhì)控菌株主要是銅綠假單胞菌（ATCC27853）、大腸埃希菌（ATCC35218）。

1.1.2 對(duì)儀器和試劑進(jìn)行選擇，選用美國MicroScan40的微生物全自動(dòng)進(jìn)行鑒定的藥敏分析儀器、電泳儀和PCR擴(kuò)增儀，成像系統(tǒng)選擇UVI凝膠成像儀器。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn)選擇微量肉湯的稀釋法，采用藥敏分析儀，對(duì)抗菌藥物的敏感性進(jìn)行測(cè)定，藥敏結(jié)果的主要判斷依據(jù)是2010年美國的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化的研究所標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.2.2 模板制備主要采用煮沸法，選擇已經(jīng)分純的多個(gè)菌落到離心管，離心管里面置入滅菌蒸餾水0.5mL，經(jīng)過10min的煮沸之后立刻放在冰上進(jìn)行冷卻冷卻，在4℃1200r/min進(jìn)行離心5min，選取無菌清液作為DNA模板液，放置在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.3 對(duì)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，選擇PCR法，β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)耐藥基因PCC擴(kuò)增引物的序列如表1所示，氨基糖苷類修飾酶基因PCR擴(kuò)增引物序列如表2所示。靶基因PCR的反應(yīng)體系主要包括Premix Tag酶體系25μL、上下游的引物各10pmol、模板DNA 4μL、用ddH2O進(jìn)行補(bǔ)足，一直到50μL。熱循環(huán)的參數(shù)都是：首先是94℃預(yù)變性的45s，然后94℃45s→55℃45s→72℃1min，一共循環(huán)35個(gè)周期，最后的72℃延伸到10min。取出5μL產(chǎn)物經(jīng)過2%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)基因陽性主要表現(xiàn)為出現(xiàn)目的條帶，最后選擇凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察、保存攝像[5]。

表1 β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)耐藥基因PCC擴(kuò)增引物的序列

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

30株鮑曼不動(dòng)桿菌除對(duì)阿米卡星和左氧氟沙星耐藥率分別為23.3%和30.0%外，對(duì)其他抗菌藥物均達(dá)80.0%以上。見表2。

表2 30株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)15種抗菌藥物的耐藥情況（%）

2.2 基因PCR檢測(cè)結(jié)果

30株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢出β-內(nèi)酰胺酶基因26株，檢出率為86.7%。20株（66.7%）OXA-23樣陽性，18株（60.0%）OXA-51樣陽性，18株（60.0%）AMPC酶陽性，5株（16.6%）TEM陽性，4株13.3%SHV陽性，3株（10%）PER陽性。同時(shí)攜帶3種或以上耐藥基因有14株（46.7%），其中14株同時(shí)攜帶OXA-23+OXA-51+AMPC，2株SHV同時(shí)攜帶OXA-23+OXA-51+AMPC，2株P(guān)ER同時(shí)攜帶OXA-23+OXA-51+AMPC基因，5株TEM同時(shí)攜帶AMPC酶基因。未檢出VIM、IMP、OXA-24、OXA-58、CTX-M-9以及DHA組。

3 討 論

隨著抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥鮑曼的不動(dòng)桿菌比例也在不斷地上升，鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院感染常見的病原菌之一，也是目前能夠引起醫(yī)院內(nèi)感染的一種重要的病原菌成為了臨床治療中的棘手難題。對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，能夠讓耐藥基因在醫(yī)院的流行和散播進(jìn)行有效控制。β內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗菌藥物曾經(jīng)是ABA菌感染治療的首選藥物。近年來，由產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶ABA菌引起的感染發(fā)病率在逐年上升，暴發(fā)或流行時(shí)有發(fā)生[2-5]。本組研究顯示，從臨床各類標(biāo)本中均可分離出該菌，包括痰液、傷口分泌物和中段尿等，但尤其集中在痰液標(biāo)本，且分布科室集中在中心ICU和神經(jīng)外科ICU，說明多重耐藥ABA菌是引起ICU病房獲得性肺炎的重要病因菌之一。本組研究藥敏結(jié)果多重耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)亞胺培南耐藥率60.2%，對(duì)三代以上頭孢菌素耐藥率均在70.0%以上，因此，應(yīng)規(guī)范該類抗菌藥物的應(yīng)用，加強(qiáng)抗生素的使用管理，延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[6-7]。

鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基制復(fù)雜，其通過產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶、金屬β-內(nèi)酰胺酶、質(zhì)粒頭孢菌素酶及外膜孔蛋白OprD2缺失等，對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，因此其耐藥情況嚴(yán)重，攜帶多種β-內(nèi)酰胺酶基因且同一菌株同時(shí)攜帶3種以上β-內(nèi)酰胺酶基因比率高[8]。細(xì)菌耐藥情況應(yīng)引起臨床高度重視。合理應(yīng)用抗菌藥物，采取有效措施控制耐藥菌株的出現(xiàn)，及時(shí)切斷多重耐藥菌株的傳播。

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[6]王輝,孫紅莉,廖康,等.北京和廣州地區(qū)四家醫(yī)藥不動(dòng)桿菌碳青霉烯基因型研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(6):636-641.

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：1671-8194（2013）05-0080-02