HPLC－ELSD測定綏陽山銀花中綠原酸和灰氈毛忍冬皂苷乙的含量＊

張 艷，周旭美，姚曉東，張倩茹，蘭 雪

(遵義醫(yī)學院藥學院藥物分析教研室，貴州遵義 563099)

綏陽山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides.Hard.－Mazz.干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒，疏散風熱的功能，主要用于治療癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫熱發(fā)病等［1］。山銀花的化學成分復雜，且當前研究主要集中在有機酸類［2］、揮發(fā)油類［3］、黃酮類［4］、皂苷類［5］等成分，賀清輝等［6］首次從紅腺忍冬藤莖乙醇提取物中分離得到灰氈毛忍冬皂苷乙。由于灰氈毛忍冬皂苷乙和綠原酸極性差別大，且前者無紫外吸收，我們采用高效液相色譜與蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用的方法［5］同時測定山銀花中的綠原酸和灰氈毛忍冬皂苷乙，以此評價綏陽山銀花的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC－20A高效液相色譜儀(自動進樣器:SIL－20A;輸液單元:LC－20AT;系統(tǒng)控制器:CMB－20A;柱溫箱:CTO－10ASvp;檢測器:ELSD－LTⅡ)，實驗室超純水機(型號 Dura 12)，電子天平(型號FA2004N52794)。乙腈為色譜純，乙酸、甲醇均為分析純，水為超純水。

1.2 試藥 綠原酸(批號110753－ 200413，20 mg)，灰氈毛忍冬皂苷乙(批號111814－201102，20 mg，含量88.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院。山銀花采摘于貴州省綏陽縣，經(jīng)遵義醫(yī)學院生藥學教研室主任楊建文教授鑒定為灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides.Hard.－ Mazz.的干燥花蕾。憑證標本存放于遵義醫(yī)學院生藥學標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 供試品溶液 稱取山銀花的干燥粉末(過四號篩)0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)40 min，放冷，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.1.2 單一對照品溶液 精密稱取綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙對照品適量，分別置5 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，制成濃度分別為綠原酸0.643 2mg/mL、灰氈毛忍冬皂苷乙 0.772 8 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.1.3 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸與灰氈毛忍冬皂苷乙對照品適量于5 mL容量瓶，加50%甲醇溶解并定容，制成含0.514 0 mg/mL的綠原酸、0.516 mg/mL的灰氈毛忍冬皂苷乙的混合對照品溶液。

2.2 方法學考察

2.2.1 色譜條件 采用Phenomenex Luna C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)色譜柱，乙腈為流動相 A，0.4%醋酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫(0～10 min，11.5%A→15%A;10 ～12 min，15%A →29%A;12～18 min，29%A→33%A;18 ～30 min，33%A→45%A)，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40℃。

2.2.2 系統(tǒng)適應性考察 混合對照品溶液與供試品溶液按“2.2.1”項下色譜條件進樣，HPLC色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按綠原酸峰面積計算大于1000，綠原酸與灰氈毛忍冬皂苷乙的分離度大于1.5。

圖1 混合對照品(左)和山銀花樣品(右)HPLC－ELSD色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系的考察 精密量取綠原酸和灰氈毛忍冬皂苷乙的對照品混合液依次稀釋0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍。在上述色譜條件下，依次進樣10 μL，以峰面積y與對照品溶液的濃度x進行線性回歸，分別得到綠原酸與灰氈毛忍冬皂苷乙的線性回歸方程:y綠原酸=4609x－300.53(R2=0.9995);y灰氈毛忍冬皂苷乙=581 0.1x － 421.19(R2=0.998 8)。線性范圍依次是:0.080 4 ～0.643 2 mg/mL，0.096 6 ～0.772 8 mg/mL。

2.2.4 精密度實驗 取山銀花樣品約0.2 g，精密稱定，按“2.1.1”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次，每次進樣10 μL。綠原酸和灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積的RSD(n=6)分別為0.76%和0.77%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性實驗 取同一山銀花樣品6份，各約0.2 g，精密稱定，按“2.1.1”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣10 μL。綠原酸與灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積的 RSD(n=6)分別為0.85%、0.50%，表明本方法重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 取山銀花樣品約0.2 g，精密稱定，按“2.1.1”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件于 0、2、4、8、12、24 h 分別進樣 10 μL。綠原酸與灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積RSD(n=6)分別為1.5%、2.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.7 加樣回收率實驗 取山銀花樣品9份，各約0.2 g，精密稱定，按“2.1.1”項制備供試品溶液，各取5 mL供試品溶液于10 mL容量瓶，加入一定體積的綠原酸對照品溶液及灰氈毛忍冬皂苷乙對照品溶液，50%甲醇定容，0.45 μm 濾膜過濾，按“2.2.1”項色譜條件進樣 10 μL，加樣回收率結(jié)果(見表1、表2)。

表1 綠原酸加樣回收率結(jié)果

表2 灰氈毛忍冬加樣回收率結(jié)果

2.2.8 樣品含量測定 取山銀花樣品6份，各約0.2 g，精密稱定，按“2.1.1”項制備供試品溶液，按“2.2.1”項色譜條件進樣 10 μL，含量測定結(jié)果(見表3)。

表3 山銀花樣品含量測定結(jié)果

3 討論

蒸發(fā)光散射檢測器可檢測揮發(fā)性低于流動相的任何樣品，而不需要樣品含有發(fā)色基團。蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)［7］。綠原酸與灰氈毛忍冬皂苷乙的極性差別較大，需要用梯度洗脫進行同時含量測定，蒸發(fā)光散射器很好的解決了梯度變化過程中基線不穩(wěn)的問題。

本研究建立了HPLC－ELSD聯(lián)用的方法［8－9］，可同時測定綏陽山銀花中的的綠原酸成分和灰氈毛忍冬皂苷乙的含量，綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙的平均含量分別為4.45%、7.94%，均高于2010版《中國藥典》一部規(guī)定的2.0%和5.0%，說明綏陽山銀花的品質(zhì)較好，綏陽山銀花具有潛在的深度開發(fā)價值。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010:28－29.

［2］Wu H Z，Luo J，Yin Y X，et al.Effects of chlorogenic acid，an active compound activating calcineurin，purified from Flos Lonicerae on macrophage［J］.Acta Pharmacol Sin，2004，25(12):1685 －1689.

［3］李會軍，張重義，李萍.忍冬不同藥用部位揮發(fā)油成分分析［J］.中藥材，2002，25(7):476 －477.

［4］Chen J，Li S L，Li P，et al.Qualitative and quantitative analysis of active flavonoids in Flos Lonicerae by capillary zone electrophoresis coupled with solid－phase extraction［J］.Journal of Separation Science，2005，28(4):365 －72.

［5］Li H J，Li P，Ye W C.Determination of five major iridoid glucosides in Flos Lonicerae by high－performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection［J］.J Chromatogr A，2003，1008(2):167 －172.

［6］賀清輝，李會軍，畢志明，等.紅腺忍冬藤莖的化學成分［J］.中國天然藥物，2006，4(5):385 －386.

［7］Chai X Y，Lin S，Li P.Quality evaluation of Flos Lonicerae through a simultaneous determination of seven saponins by HPLC with ELSD［J］.Journal of Chromatography A，2005，1070(1－2):43－48.

［8］張璐，曾文雪.HPLC－ELSD同時測定山銀花中綠原酸、木犀草苷和川續(xù)斷皂苷乙的含量［J］.江西中醫(yī)學院學報，2011，23(4):40 －42.

［9］李會軍，李萍.HPLC－ELSD法測定金銀花中常春藤皂苷元及齊墩果酸的含量［J］.藥物分析雜志，2006，26(6):820－822.