VEGF和MVD在大腸癌中的表達及預后意義＊

駱禮波，程家平，楊偉明，楊雪峰，石 磊，賀新媛，劉 勤，蘇曉玥，任 宇

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 胃腸外科，貴州 遵義563099)

大腸癌是常見消化道惡性腫瘤，影響患者預后是腫瘤的侵襲和轉移能力。1971年，F(xiàn)olkman等就提出了“腫瘤血管生長因子理論”，認為:腫瘤的生長及轉移依賴于新生血管生成［1］。多項研究表明，VEGF是目前研究較多，也較成熟的腫瘤新生血管誘發(fā)因子。Sharma等［2］指出MVD最有價值的是能預測實體腫瘤的侵襲和轉移，并與實體腫瘤各種預后因素有關，是預測全身和局部復發(fā)及無病生存的重要指標。運用VEGF和MVD對大腸癌患者生存期進行評估，國內文獻報道相對較少。本研究運用免疫組化方法(Envision法)來探討VEGF和MVD在大腸癌組織中的表達與患者的病理特征與生存預后的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外科1997年3月至2007年2月生存期≥5年(甲組)及≤3年(乙組)大腸癌患者組織標本各30例。所有標本均經病理證實為大腸癌組織，全部患者均為第一次手術，術前均未接受任何放、化療和其它治療。甲組:男14例，女16例;年齡30～79(中位年齡50.1)歲。Dukes分期，A+B期16例，C+D期14例;有淋巴結轉移11例，無淋巴結轉移者19例。乙組:男18例，女12例;年齡27～73(中位年齡56.1)歲;Dukes分期，A+B期14例，C+D期16例;有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移者14例。60例中，29例未突破肌層，其余31例全部侵潤至漿膜及漿膜層外。分化程度:高分化腺癌28例、中低分化腺癌及粘液腺癌32例。手術方式:Dixon術式32例;Hartmann術式14例;Mile，s術式24例。除3例因各種原因，未能進行放化療，其余患者均采用folfox方案規(guī)范完成6個療程化療。

1.2 免疫組化試劑，儀器及其他耗材 特異性一抗是兔抗人VEGF單克隆抗體(編號M7273，工作液濃度1∶25)購于Dako公司;鼠抗人CD34單克隆抗體(工作液濃度1∶100)購于福州邁新公司。二抗試劑盒(編號GK500705，包括Envision二抗檢測即用型，DAB顯色試劑)購于美國基因公司。經多聚賴氨酸處理的防脫玻片，PBS緩沖液，EDTA抗原修復液及一抗稀釋液均購于北京中杉金橋公司。另二甲苯，酒精，雙氧水，蘇木素，微波爐均為實驗室自備。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化染色 石蠟組織切割成4 μm厚切片，均經HE染色再次確認為所選組織學診斷后行免疫組化染色。二甲苯梯度脫蠟兩次，每次10 min，乙醇梯度水化，3%雙氧水浸泡10 min去除內源性過氧化物酶，EDTA微波修復抗原(CD34為10 min，VEGF為20 min)，自然冷卻后 PBS液沖洗3次，每次5分鐘，加一抗后4℃過夜。第二次PBS液沖洗3次，每次5分鐘。滴加二抗，室溫30℃后再次PBS液沖洗3次，每次5分鐘。DAB顯色，蘇木素復染細胞核，乙醇梯度脫水，透明，中性樹膠封片。以VEGF，CD34強陽性片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結果判定

1.3.2.1 VEGF判斷 以胞漿內出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，每張切片選取10個不同部位，400倍視野下計數(shù)，采用Volm［3］標準，按陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例和染色深度進行評分和分級。染色強度分級:無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色及更深顏色為2分;陽性細胞分級:陽性細胞數(shù)≤50%為0，＞50% ～75%為1分，＞75%為2分。兩項得分相加，結果2分為陽性表達。

1.3.2.2 MVD判斷 作為目前標記微血管最主要的CD34，其以血管內皮細胞胞膜染成棕黃色或棕褐色為陽性表達。MVD計數(shù)參照Maeda等［4］報道方法，計數(shù)5個高倍鏡視野(×200)內微血管數(shù)，取平均數(shù)為該組織MVD值。以上免疫組化染色結果均由具備多年病理診斷經驗的技術人員2人采用雙盲法參與判定。

1.3.3 統(tǒng)計學處理 實驗結果采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用檢驗，采用Spearman等級相關進行相關性分析。檢驗水準α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGF，MVD 表達與性別，年齡，分化程度及病理分型關系 免疫組化顯示:大腸癌組織中VEGF主要表達于腫瘤細胞的細胞漿或胞膜內，以胞漿內出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒陽性染色為主，以癌巢邊緣著色最明顯，表明VEGF表達最明顯的部位位于腫瘤細胞浸潤的前緣(見圖1)。CD34是目前運用最多，也是較為成熟的標記微血管的蛋白，以血管內皮細胞胞膜染成棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。主要表達于腫瘤間質區(qū)，微血管數(shù)量以腫瘤周邊相對較多(見圖2)。60例中，VEGF陽性表達率為53.3%(32/60)，MVD 值為32～72，平均為46.77。兩者與性別，年齡，分化程度及病理分型無關(見表1)。

2.2 VEGF，MVD 表達與浸潤深度，臨床分期，淋巴結轉移間關系 VEGF，MVD在癌細胞浸潤的漿膜及漿膜外，C+D期，有淋巴結轉移的表達分別為67.7%(21/31)，66.7%(20/30)，70.4%(19/27);50.45 ±11.34，51.47 ±10.60，51.74 ±10.02 。均顯著高于肌層，A+B期，無淋巴結轉移的37.9%(11/29)，40.0%(12/30)，39.4%(13/33)，42.83±7.15.42，07 ±7.36.42，70 ±8.54，差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

2.3 VEGF，MVD表達與生存期，患者的預后關系生存期≥5年的大腸癌患者與≤3年的大腸癌患者血管內皮生長因子表達分別為36.7%(11/30)，70.0%(21/30)，而生存期≥5年的大腸癌患者與≤3年的大腸癌患者微血管密度表達分別為41.53±6.08，52.00 ±10.89。差異較為顯著，有統(tǒng)計學意義(＜0.001)。本實驗發(fā)現(xiàn)，VEGF著色及陽性細胞數(shù)表達越多的切片，相對應的MVD值越高。兩者呈正相關(r=0.974，P ＜0.05)。

表1 大腸癌組織中VEGF、MVD的表達與臨床病理參數(shù)關系

3 討論

Folkman指出:血管的形成根據(jù)腫瘤的發(fā)展分為血管前期和血管期。在血管前期，實體瘤緩慢生長或不生長，多數(shù)直徑不超過1 mm，很少向周圍浸潤，幾乎不發(fā)生轉移［5］。一旦進入血管期，腫瘤必須要建立自身的血管系統(tǒng)以獲得充足的氧和營養(yǎng)成分，生長速度加快，瘤體向周圍侵襲。由于新生腫瘤血管內皮細胞不完整或基底膜中斷，缺如、脫落腫瘤細胞容易進入血液循環(huán)，引起腫瘤的侵襲，轉移。可以說，腫瘤血管的新生在腫瘤良惡性間，惡性腫瘤分期及淋巴結轉移間扮演了極其重要角色。血管的新生需要多種誘發(fā)因子，如細胞因子，生長因子，細胞外基質復合物(ECM)等［6］。作為生長因子的VEGF家族是多種靜脈及毛細血管的有絲分裂原，與腫瘤的侵襲，轉移密切相關［7］，它由腫瘤細胞分泌且相對分子量為34～46KD，具有生物活性的糖蛋白單體以二硫鍵構成的二聚體。VEGF家族包刮 VEGF－A，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D等，通常說的VEGF是指VEGF－A。研究表明，VEGF被認為是最主要的血管形成因子［8］，主要表達于腫瘤細胞的細胞漿或胞膜內，腫瘤組織內間質和臨近正常組織內也可見少量表達。它以下列兩種方式引起腫瘤生長:①以旁分泌方式刺激血管內皮細胞增值，誘發(fā)腫瘤血管再生;②可以作為自分泌因子作用于腫瘤細胞自身的VEGF受體促進腫瘤生長。MVD是腫瘤微血管形成程度的標志和腫瘤的生物學特征，是目前評定腫瘤血管生成狀態(tài)的最佳指標。已有多項研究表明，在卵巢癌，肝內膽管癌，乳腺癌等的MVD的高低與腫瘤的復發(fā)和轉移密切相關［9－11］。

本實驗表明，VEGF陽性表達越高的組織，其MVD測量值越大，說明VEGF確實在惡性腫瘤新生血管的形成中起重要作用。VEGF的高表達和大腸癌的Dukes分期，癌組織浸潤，淋巴結轉移和預后密切相關，VEGF對大腸癌的生長和轉移有促進作用。Kang等［12］采用免疫組化法分析大腸癌VEGF表達陽性與腫瘤血管分布，肝轉移的關系，發(fā)現(xiàn)有肝轉移和靜脈浸潤的患者，其癌細胞VEGF表達陽性率高于無轉移者，且陽性患者微血管含量較陰性高，與國內張濤、王瑞婷等［13－14］報道的相一致。檢測VEGF及MVD的表達可以成為判斷大腸癌的進展情況及為預后提供依據(jù)。

由于血管內皮細胞遺傳學上穩(wěn)定，突變率低，所以針對內皮細胞的藥物較少出現(xiàn)耐藥的問題［13］。因此阻斷大腸癌細胞表達的VEGF信號傳遞可以防止腫瘤的生長。BREDOW等［15］用反義寡核苷酸治療腎癌，在裸鼠腫瘤模型中，可以明顯降低VEGF的表達和微血管密度以抑制腫瘤生長，抗VEGF的中和性單抗具有廣譜的抗腫瘤作用，對移植于裸鼠的人體癌瘤有明顯療效。所以抑制VEGF的活性肯定能遏制大腸癌的發(fā)展，以VEGF為靶點的生物治療大腸癌有很大的發(fā)展空間。

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