丙谷胺、阿司匹林對人結腸癌HT－29細胞增殖的抑制作用＊

朱 蓉，趙 逵，方興國，付曉菲，狄連君，陳小燕，李優(yōu)鋒

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內科，貴州遵義 563099)

大腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因、多階段、多因素的復雜病變過程。胃泌素(Gastrin，GAS)是研究最早、最多的胃腸激素，它通過多種機制促進大腸癌的發(fā)生發(fā)展［1－2］。前列腺素 E2(Prostaglandin E2，PGE2)是體內花生四烯酸轉化生成的生物活性物質之一，環(huán)氧合酶－2(Cyclooxygenase－2，COX－2)及15－羥基前列腺素脫氫酶(15－h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase，15－PGDH)分別是PGE2合成和降解的限速酶，它們在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中都起著重要的作用［3－6］。Yao等［7］研究顯示，GAS能夠誘導胃癌細胞中COX－2表達，特異性COX－2抑制劑NS－398能有效逆轉GAS對結腸癌細胞的促增殖作用。本課題采用體外培養(yǎng)人結腸癌細胞株HT－29，并采用丙谷胺和阿司匹林進行干預，觀察丙谷胺、阿司匹林及兩者聯(lián)合使用時對HT－29細胞生長增殖的影響以及COX－2和15－PGDH的變化。旨在為大腸癌治療的聯(lián)合用藥提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌細胞株HT－29購自中科院上海細胞庫;Macoy’s 5A培養(yǎng)基(改良)購自Sigma公司;胎牛血清購自Biochrom公司;丙谷胺鈉、阿司匹林和MTT均購自Sigma公司;Trizol試劑購自Invitrogen公司;COX－2，15－PGDH，βactin引物由大連寶生物工程有限公司合成;逆轉錄和熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;抗COX－2多克隆抗體購自Santa Cruz公司;抗15－PGDH多克隆抗體購自Cayman公司;PCR儀購自美國BioRad公司;凝膠成像系統(tǒng)購自Sygene公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的傳代培養(yǎng) 人結腸癌細胞株HT－29培養(yǎng)于含10%胎牛血清的Macoy’s 5A完全培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁生長至70% ～80%融合時，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA混合液進行消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT比色法檢測丙谷胺、阿司匹林對HT－29細胞生長增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的細胞經消化后，用完全培養(yǎng)液稀釋至5×104/mL的單細胞懸液，接種于96孔板，100 μL/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，分組進行MTT比色實驗。丙谷胺組:丙谷胺終濃度分別為1.0 mmol/L、5.0 mmol/L、10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L;阿司匹林組:阿司匹林終濃度分別為 0.1 mmol/L、1.0 mmol/L、5.0 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L;對照組:不加藥物。每組設10個復孔，各組細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，在每孔中加入0.5%MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，使結晶顆粒充分溶解，酶標儀測定490 nm波長處的OD值，試驗重復3次。細胞的生長抑制率=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%;經過上述實驗，分別得出丙谷胺和阿司匹林對細胞生長增殖的半數(shù)抑制濃度IC50，再如同上法進行聯(lián)合干預用藥，實驗分為對照組、丙谷胺組(IC50)、阿司匹林組(IC50)和聯(lián)合用藥組(丙谷胺 IC50+阿司匹林IC50)。

1.2.3 Real－time PCR 檢測 HT－29細胞 COX －2和15－PGDH mRNA的表達 取對數(shù)生長期的HT－29細胞，調整細胞濃度為5×104/mL進行接種，同上法培養(yǎng)，實驗分為對照組、丙谷胺組(IC50)、阿司匹林組(IC50)和聯(lián)合用藥組(丙谷胺IC50+阿司匹林IC50)，培養(yǎng)48 h后，按照Trizol試劑盒說明書操作步驟進行細胞總RNA的提取，紫外分光光度計法定量RNA;按逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，RT反應體系20 μL;從 GeneBank查出相關引物序列，由大連寶生物工程有限公司合成(見表1);根據PCR試劑盒說明書，梯度稀釋模板cDNA制作標準曲線;Real－time PCR反應體系為20μL，反應條件:預變性95℃10 s，1 Cycle;PCR反應95℃ 5 s，58.5℃ 20 s，40 Cycles;融解曲線分析55℃10 s，80 Cycles;結果分析處理采用相對定量法。

表1 PCR引物列表

1.2.4 Western－blot法檢測 HT－29細胞 COX －2和15－PGDH蛋白的表達 取對數(shù)生長期的HT－29細胞，培養(yǎng)方法及分組均同Real－time PCR實驗，收集標本進行蛋白質的提取，按照BCA法蛋白定量試劑盒操作說明書進行蛋白定量。配膠，上樣，電泳，制作“三文治”結構，電轉，封閉，加入一抗，洗滌，加入二抗，洗滌，發(fā)光，X片顯影，定影，分析結果。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據按完全隨機對照設計的要求收集整理，所有數(shù)據以均數(shù)±標準差(s)表示，并采用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計學軟件包進行處理，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 丙谷胺和阿司匹林對HT－29細胞生長增殖的抑制作用 MTT結果顯示，隨著丙谷胺和阿司匹林藥物濃度的增加和作用時間的延長，HT－29細胞的生長增殖速率逐漸減慢，丙谷胺和阿司匹林均呈時間和劑量依賴性地抑制HT－29細胞的生長增殖(見圖1)，經計算得出干預48 h時丙谷胺的 IC50為20.248 mmol/L，阿司匹林的 IC50為4.996 mmol/L。選取兩藥的半數(shù)抑制濃度(丙谷胺取20 mmol/L，阿司匹林取5 mmol/L)進行單一及聯(lián)合用藥干預48 h，結果顯示，聯(lián)合用藥組的抑制率與丙谷胺或阿司匹林單一用藥組相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見圖2)。根據金正均方法［8］計算q值判斷藥物相互作用結果，丙谷胺和阿司匹林聯(lián)合作用48 h后，q值為1.152，提示丙谷胺和阿司匹林聯(lián)合應用具有協(xié)同抑制HT－29細胞生長增殖的作用。

圖1 MTT法分別檢測丙谷胺和阿司匹林對人結腸癌HT－29細胞生長增殖的抑制作用

2.2 丙谷胺和阿司匹林對HT－29細胞COX－2和15－PGDH mRNA表達的影響 Real－time PCR結果顯示，丙谷胺和阿司匹林單一及聯(lián)合用藥作用于HT－29細胞48 h后，各組COX－2 mRNA的表達均低于對照組，聯(lián)合用藥組COX－2 mRNA的表達低于各單一用藥組;丙谷胺組與對照組，聯(lián)合用藥組與各單一用藥組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);阿司匹林組與對照組比較，雖有所降低，但差異不顯著(P＞0.05)。而各組15－PGDH mRNA的表達均高于對照組，聯(lián)合用藥組15－PGDH mRNA的表達高于各單一用藥組;丙谷胺組與對照組，聯(lián)合用藥組與各單一用藥組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);阿司匹林組與對照組比較，雖有所升高，但差異不顯著(P ＞0.05，見圖3)。

圖2 丙谷胺、阿司匹林聯(lián)合用藥對HT－29細胞生長增殖的協(xié)同抑制作用

圖3 Real－time PCR檢測COX－2和15－PGDH mRNA在不同組別的表達

2.3 丙谷胺和阿司匹林對HT－29細胞COX－2和15－PGDH蛋白質表達的影響 Western－blot結果顯示，丙谷胺和阿司匹林單一及聯(lián)合用藥作用于HT－29細胞48h后，阿司匹林組COX－2蛋白的校準值(COX－2蛋白的積分光密度值/βactin蛋白的積分光密度值)為0.605±0.102，丙谷胺組COX－2蛋白的校準值為0.555±0.132，均低于對照組的0.613±0.114;聯(lián)合用藥組COX－2蛋白的校準值為0.476±0.078，低于各單一用藥組;丙谷胺組與對照組，聯(lián)合用藥組與各單一用藥組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);阿司匹林組與對照組比較，雖有所降低，但差異不顯著(P＞0.05)。相反，丙谷胺和阿司匹林單一及聯(lián)合用藥作用于HT－29細胞后，阿司匹林組15－PGDH蛋白的校準值(15－PGDH蛋白的積分光密度值/β－actin蛋白的積分光密度值)為0.201±0.070，丙谷胺組蛋白的校準值為0.317±0.097，均高于對照組的0.187±0.058;聯(lián)合用藥組15－PGDH 蛋白的校準值為0.445±0.107，高于各單一用藥組(P＜0.05);丙谷胺組與對照組，聯(lián)合用藥組與各單一用藥組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);阿司匹林組與對照組比較，雖有所升高，但差異不顯著(P＞0.05，見圖4)。

圖4 Western blot檢測COX－2和15－PGDH蛋白質在不同組別的表達

3 討論

大腸癌的治療一直是一大難點。近年來大量流行病學和實驗室研究均表明GAS、COX－2及15－PGDH在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中均扮演著重要的角色，GAS通過多種分子機制促進大腸癌細胞的增殖，抑制其凋亡。NSAIDs如阿司匹林能抑制甚至逆轉大腸癌癌前病變，降低大腸癌的發(fā)病率和死亡率，但存在因需長期、大劑量服用該類藥物，從而導致胃腸道出血等潛在風險［9－11］。目前研究已證實GAS受體拮抗劑和NSAIDs均各自具有抑制大腸癌細胞生長增殖的作用，但對于GAS受體拮抗劑和NSAIDs聯(lián)合應用是否對大腸癌細胞生長增殖具有協(xié)同抑制作用目前還不清楚。本實驗結果顯示，丙谷胺、阿司匹林均呈時間和劑量依賴性地抑制結腸癌HT－29細胞的生長增殖，發(fā)現(xiàn)二藥聯(lián)合應用時對HT－29結腸癌細胞生長增殖的抑制作用更加明顯。提示兩者之間可能存在協(xié)同作用。對胃癌的研究已發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應用GAS受體拮抗劑和選擇性COX－2抑制劑對體外培養(yǎng)的胃癌細胞株具有協(xié)同抑制其生長增殖和促進其凋亡的作用［12］。且本實驗未使用外源性GAS，說明結腸癌HT－29細胞可能自分泌GAS，而丙谷胺則可能通過與HT－29細胞自分泌的GAS競爭GAS受體，從而抑制結腸癌HT－29細胞的生長增殖。

NSAIDs包括非選擇性COX抑制劑和選擇性COX－2抑制劑，它們的抗腫瘤作用一方面是通過COX 途徑實現(xiàn)的［13－14］，另一方面，NSAIDs預防癌發(fā)生也有非COX途徑，包括增強免疫、抑制血管生成、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤干細胞標記物表達和抗氧化作用等［15－18］。本研究應用阿司匹林干預后，HT－29細胞的COX－2 mRNA和蛋白質的表達有所降低、15－PGDH mRNA和蛋白質的表達有所增加，但是無統(tǒng)計學意義，表明阿司匹林抑制結腸癌細胞的生長增殖可能有非COX－2途徑，且非COX－2途徑可能起主要作用［19］。

COX－2、15－PGDH又分別是PGE2合成和降解的限速酶，PGE2可通過調節(jié)細胞增殖和凋亡，調節(jié)血管生成和免疫反應等從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［20］?，F(xiàn)已有實驗證實下調COX－2表達，上調15－PGDH表達，從而減少PGE2的生物合成，可抑制結腸癌細胞的生長增殖［21－22］。本實驗結果表明，丙谷胺可通過下調COX－2表達、上調15－PGDH表達，從而抑制HT－29細胞的生長增殖。大量研究表明，COX－2在正常大腸上皮細胞中幾乎不表達，在腺瘤中表達有所增加，而在大腸癌組織中呈高表達，其高表達與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移和復發(fā)均密切相關，COX－2通過多種作用機制促進大腸癌的發(fā)生和發(fā)展［23］。15－PGDH是前列腺素生物滅活的關鍵酶，可催化活性15－羥基PG氧化成為活性較弱的15－酮基PG，對COX－2有天然拮抗作用［24］。研究發(fā)現(xiàn)，15－PGDH在正常結腸組織中呈高表達，而在結腸癌組織中表達減少甚至缺失［25］。15－PGDH的表達減少或缺失與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，但15－PGDH抑制結腸癌的作用機制目前尚不十分清楚，可能通過多種機制［26－29］。NSAIDs能夠上調結腸癌細胞中15－PGDH的表達［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，丙谷胺與阿司匹林聯(lián)用后對COX－2下調、15－PGDH上調表達的調節(jié)作用更加明顯。但兩者之間協(xié)同作用的機制目前仍不清楚，尚待進一步研究。

［1］Jin G，Westphalen C B，Hayakawa Y，et al.Progastrin Stimulates Colonic Cell Proliferation via CCKBR－and β－Arrestin－Dependent Suppression of BMP2［J］.Gastroenterology，2013，145(4):820－830.

［2］Singh P，Sarkar S，Kantara C，et al.Progastrin Peptides Increase the Risk of Developing Colonic Tumors:Impact on Colonic Stem Cells［J］.Curr Colorectal Cancer Rep，2012，8(4):277－289.

［3］Roberts H R，Smartt H J，Greenhough A，et al.Colon tumour cells increase PGE(2)by regulating COX－2 and 15－PGDH to promote survival during the microenvironmental stress of glucose deprivation ［J］.Carcinogenesis，2011，32(11):1741－1747.

［4］Kisslov L，Hadad N，Rosengraten M，et al.HT－29 human colon cancer cell proliferation is regulated by cytosolic phospholipase A(2)α dependent PGE(2)via both PKA and PKB pathways［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1821(9):1224－1234.

［5］Thompson C L，F(xiàn)ink S P，Lutterbaugh J D，et al.Genetic variation in 15－h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase and colon cancer susceptibility［J］.PLoS One，2013，8(5):e64122.

［6］Jiang Y，Turgeon D K，Wright B D，et al.Effect of ginger root on cyclooxygenase－1 and 15－h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase expression in colonic mucosa of humans at normal and increased risk for colorectal cancer［J］.Eur J Cancer Prev，2013，22(5):455 －460.

［7］Yao M，Song D H，Rana B，et al.COX－2 selective inhibition reverses the trophic properties of gastrin in colorectal cancer［J］.Br J Cancer，2002，87(5):574 －579.

［8］金正均.合并用藥中的相加［J］.中國藥理學報，1980，1(2):70－76.

［9］Reimers M S，Bastiaannet E，van Herk－Sukel M P，et al.Aspirin use after diagnosis improves survival in older adults with colon cancer:a retrospective cohort study［J］.J Am Geriatr Soc，2012，60(12):2232－2236.

［10］Ouyang N，Ji P，Williams J L.A novel NSAID derivative，phospho－ibuprofen，prevents AOM －induced colon cancer in rats［J］.Int J Oncol，2013，42(2):643－650.

［11］Flossmann E，Rothwell P M.Effect of aspirin on longterm risk of colorectal cancer:consistent evidence from randomised and observational studies ［J］.Lancet，2007，369(9573):1603 －1613.

［12］孫為豪，蘇菡，章禮久，等.胃泌素受體拮抗劑與環(huán)氧合酶－2抑制劑對胃癌細胞增殖和凋亡的影響［J］.中華醫(yī)學雜志，2006，861(4):250－254.

［13］Moon C M，Kwon J H，Kim J S，et al.Nonsteroidal anti－inflammatory drugs suppress cancer stem cells via inhibiting PTGS2(cyclooxygenase 2)and NOTCH/HES1 and activating PPARG in colorectal cancer［J］.Int J Cancer，2013，134(3):519 －529.

［14］Gurpinar E，Grizzle W E，Piazza G A.COX －Independent Mechanisms of Cancer Chemoprevention by Anti－Inflammatory Drugs［J］.Front Oncol，2013，3:181.

［15］Lee C S，McNamara D，O＇Morain C A.Aspirin as a chemoprevention agent for colorectal cancer［J］.Curr Drug Metab，2012，13(9):1313－1322.

［16］Tinsley H N，Grizzle W E，Abadi A，et al.New NSAID targets and derivatives for colorectal cancer chemoprevention［J］.Recent Results Cancer Res，2013，191:105－120.

［17］陳小燕，廖永美，趙逵.阿司匹林對人結腸癌細胞中腫瘤干細胞標記物Lgr5表達的影響［J］.遵義醫(yī)學院學報，2012，35(4):287－290.

［18］Vaish V，Piplani H，Rana C，et al.NSAIDs may regulate EGR－1－mediated induction of reactive oxygen species and non－steroidal anti－inflammatory drug－induced gene(NAG)－1 to initiate intrinsic pathway of apoptosis for the chemoprevention of colorectal cancer［J］.Mol Cell Biochem，2013，378(1－2):47－64.

［19］王春暉，陽欽，唐承薇，等.非甾體類抗炎藥對結腸癌細胞NAG－1基因表達的誘導［J］.生物醫(yī)學工程學雜志，2007，24(4):880－883.

［20］何磊，孟翔凌，涂從銀，等.PGE2在結直腸癌患者腫瘤組織和外周血中的臨床意義［J］.世界華人消化雜志，2011，19(2):205－208.

［21］Miyoshi J，Yajima T，Shimamura K，et al.5 － aminosalicylic acid mediates expression of cyclooxygenase－2 and 15－h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase to suppress colorectal tumorigenesis［J］.Anticancer Res，2012，32(4):1193－1202.

［22］方興國，趙逵，楊芳，等.COX－2、15－PGDH在結直息肉組織中的表達及其作用［J］.世界華人消化雜志，2011，19(9):972－975.

［23］Jang T J，Jeon K H，Jung K H.Cyclooxygenase－2 expression is related to the epithelial－to－mesenchymal transition in human colon cancers［J］.Yonsei Med J，2009，50(6):818－824.

［24］Yan M，Myung S J，F(xiàn)ink S P，et al.15－Hydroxyprostaglandin dehydrogenase inactivation as a mechanism of resistance to celecoxib chemoprevention of colon tumors［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(23):9409－9413.

［25］Kang P S，Kim J H，Moon O I，et al.Prognostic implication of 15－h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase down－regulation in patients with colorectal cancer［J］.J Korean Soc Coloproctol，2012，28(5):253 －258.

［26］Myung S J，Rerko R M，Yan M，et al.15 －Hydroxyprostaglandin dehydrogenase is an in vivo supressor of colon tumorigenesis ［J］.Proc Natl Acad Sci，2006，03(32):12098－12102.

［27］Li M，Cheng L，Chang B，Wang Y，et al.Suppression of invasive properties of colorectal carcinoma SW480 cells by 15－h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase gene［J］.Cancer Invest，2008，6(9):905 －912.

［28］Thompson C L，F(xiàn)ink S P，Lutterbaugh J D，et al.Genetic variation in 15－h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase and colon cancer susceptibility［J］.PLoS One，2013，8(5):64122.

［29］Frank B，Hoeft B，Hoffmeister M，et al.Association of hydroxyprostaglandindehydrogenase15－(NAD)(HPGD)variants and colorectal cancer risk［J］.Carcinogenesis，2011，32(2):190－196.

［30］Tai HH，Chi X，Tong M.Regulation of 15 －h(huán)ydroxyprostaglandin dehydrogenase(15－PGDH)by non－steroidal anti－inflammatory drugs(NSAIDs)［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2011，96(1 －4):37－40.