糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)A549細(xì)胞11β－羥基類固醇脫氫酶1型選擇性啟動(dòng)子的使用＊

韓巖巖

(遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義 563099)

11β－羥基類固醇脫氫酶1型(11β－HSD1，基因名字HSD11B1)為糖皮質(zhì)激素的代謝酶，它催化糖皮質(zhì)激素C11位的酮基與羥基之間的氧化還原反應(yīng)，使無(wú)活性的17羥11脫氫皮質(zhì)酮(可的松)轉(zhuǎn)化為有生物活性的皮質(zhì)醇(人類)，主要作用是調(diào)節(jié)局部組織糖皮質(zhì)激素的濃度［1］。在嚙齒類，它催化皮質(zhì)酮與脫氫皮質(zhì)酮之間的轉(zhuǎn)化［2］。11β－HSD1的表達(dá)和活性改變可導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素代謝紊亂，易引發(fā)肥胖癥、2型糖尿病、高血壓等代謝綜合征［3－5］。直到最近人們才發(fā)現(xiàn)，11β － HSD1基因的表達(dá)調(diào)控是由選擇性啟動(dòng)子控制的［6］，分別是位于遠(yuǎn)端的啟動(dòng)子1(Promoter 1，P1)和位于近端的啟動(dòng)子2(Promoter 2，P2)。目前關(guān)于11β－HSD1選擇性啟動(dòng)子的研究不是很多。糖皮質(zhì)激素是已知HSD11B1的調(diào)節(jié)子，可以誘導(dǎo)HSD11B1的表達(dá)。本文主要是探討糖皮質(zhì)激素(GC)誘導(dǎo)HSD11B1表達(dá)其選擇性啟動(dòng)子的使用情況，為進(jìn)一步研究GC誘導(dǎo)的HSD11B1表達(dá)情況和基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞(肺腺癌細(xì)胞系)培養(yǎng)在37℃5%二氧化碳90%濕度環(huán)境中，用DMEM培養(yǎng)液，添加10%的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(0.1 mg/mL)和谷氨酰胺(2 mM)，所有培養(yǎng)細(xì)胞的產(chǎn)品來(lái)自PAA實(shí)驗(yàn)室(Coelbe，德國(guó))。

1.2 提取基因組DNA 用機(jī)械法收集單層A549細(xì)胞，然后加入1 mL細(xì)胞裂解液?；蚪MDNA的提取采用酚/氯仿法:懸浮液中加入1 mL的苯酚旋渦攪拌1 min。將懸浮液在室溫下孵育5 min，然后13 000 r/min離心5 min。上相液體被轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管，加氯仿1 mL旋渦攪拌1 min，混合物再以1 3000 r/min離心1 min(兩次)。上相液體被轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管，加入兩個(gè)體積的100%乙醇，然后在13 000 r/min離心10 min。片狀DNA顆粒用2 mL 70%乙醇洗滌，然后以13 000 r/min離心5 min。最后，DNA顆粒在室溫下干燥5 min，溶于500 μL TE緩沖液。

1.3 熒光報(bào)告載體的構(gòu)建 克隆11β－HSD1遠(yuǎn)端啟動(dòng)子 1(P1，2.173 kb)和近端啟動(dòng)子(P2，2.506 kb)，用A549細(xì)胞基因組DNA為模板，引物(見(jiàn)表1)。將PCR產(chǎn)物克隆入pCR2.1－TOPO載體的多克隆位點(diǎn)，通過(guò)測(cè)序鑒定插入片段。然后將P1和P2片段再次克隆到pGL3熒光報(bào)告載體，獲得目的熒光報(bào)告載體pGL3－P1和pGL3－P2。

1.4 半定量RT－PCR A549細(xì)胞用6孔板培養(yǎng)，傳代1 d后，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%，加入皮質(zhì)醇(Cortisol，100 nM)和地塞米松(Dexamethasone，Dex，100 nM)，48 h后，提取細(xì)胞總RNA用Master Pure RNA純化試劑盒。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用2 μg總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明操作。取1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行半定量的PCR反應(yīng)，加入1 U的Phire Hotstart DNA聚合酶，1 mM的dNTP Mix，1倍的Phire反應(yīng)緩沖液，0.2 μM 的引物(見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)條件如下:初始變性時(shí)間98℃30 s;25個(gè)周期循環(huán)，98℃變性10 s，退火60℃15 s，延伸72℃15 s;最后一個(gè)延伸時(shí)間72℃10 min。最后，PCR產(chǎn)物全部用于1%凝膠電泳分離。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞用96孔板培養(yǎng)，傳代1 d后，待細(xì)胞匯合度達(dá)90%，用無(wú)抗生素細(xì)胞液換液。質(zhì)粒DNA(pGL3－P1和pGL3－P2，50 ng)分別用 25 μL Opti－ MEM Reduced Serum Medium 稀釋待用，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM2000(Invitrogen GmbH，Germany)0.3 μL 用 25 μL Opti－MEM Reduced Serum Medium稀釋，混合后室溫放置5 min。將已稀釋好的質(zhì)粒DNA與稀釋好細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑混合后室溫放置20 min，然后將50 μL的混合物加入每孔中。將細(xì)胞板放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，4 h后，將稀釋好的50 μL含有糖皮質(zhì)激素Cortisol(100 nM)和 Dexamethasone(Dex，100 nM)的溶液，加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。

1.6 熒光報(bào)告基因分析 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板移出細(xì)胞培養(yǎng)箱移去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入75 μL細(xì)胞培養(yǎng)液。然后，每孔加入75 μL Luciferase Reagent(Promega，Germany)，將細(xì)胞板上下左右來(lái)回輕輕晃動(dòng)，10 min。然后將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到96孔白色微孔板。測(cè)量firefly發(fā)光用 GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。取出平板每孔加入75 μL Dual－GloTM＆ Glo Reagent(Promega，Germany)，輕輕混合后，放置10 min。Renilla發(fā)光測(cè)量使用GENios Pro microplate reader(Tecan GmbH，Germany)。結(jié)果分析:Relative luciferase activity(%)= RLUfirefly/RLURenilla(%)，其中RLU代表相對(duì)發(fā)光單位。

2 結(jié)果

2.1 GC誘導(dǎo)HSD11B1 mRNA的表達(dá) 糖皮質(zhì)激素(GC)例如地塞米松(dexamethasone，Dex)和皮質(zhì)醇(cortisol)都是非常重要的HSD11B1的調(diào)節(jié)子，可以誘導(dǎo)HSD11B1的表達(dá)。為了探討GC誘導(dǎo)A549細(xì)胞中HSD11B1 mRNA的表達(dá)其選擇性啟動(dòng)子的使用情況，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增來(lái)自不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(見(jiàn)圖1)。A549細(xì)胞用地塞米松和皮質(zhì)醇處理48 h后，用半定量－RT－PCR的方法檢測(cè)GC誘導(dǎo)后HSD11B1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示HSD11B1 mRNA表達(dá)顯著增加經(jīng)由選擇性啟動(dòng)子P1和P2，但是P2要強(qiáng)于P1，GC主要通過(guò)介導(dǎo)P2誘導(dǎo)HSD11B1 mRNA表達(dá)(見(jiàn)圖2)。

圖1 設(shè)計(jì)引物檢測(cè)HSD11B1選擇性啟動(dòng)子(P1和P2)的使用情況

2.2 GC誘導(dǎo)熒光報(bào)告基因蛋白的表達(dá) 從A549細(xì)胞基因組中克隆11β－HSD1的兩個(gè)啟動(dòng)子的基因序列，P1片段長(zhǎng)為2.173 kb;P2片段長(zhǎng)為2.506 kb(見(jiàn)圖3)。將含有P1和P2啟動(dòng)子片段的熒光報(bào)告載體pGL3－P1和 pGL3－P2轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞。經(jīng)地塞米松和皮質(zhì)醇處理后，檢測(cè)熒光報(bào)告載體表達(dá)情況，結(jié)果顯示，GC誘導(dǎo)的P2熒光報(bào)告載體相對(duì)熒光活性顯著增加，然而P1熒光報(bào)告載體相對(duì)熒光活性沒(méi)有明顯變化(見(jiàn)圖4)。

圖2 半定量－RT－PCR檢測(cè)HSD11B1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

圖3 HSD11B1選擇性啟動(dòng)子P1和P2的PCR產(chǎn)物

圖4 GC誘導(dǎo)熒光報(bào)告基因的表達(dá)

3 討論

一直以來(lái)人們對(duì)HSD11B1基因的啟動(dòng)子研究比較少，最近人們研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控HSD11B1基因表達(dá)的啟動(dòng)子是由選擇性啟動(dòng)子決定的。選擇性啟動(dòng)子是指基因上游調(diào)控區(qū)存在的多個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，每個(gè)啟動(dòng)子所啟動(dòng)的表達(dá)模式不同，這些啟動(dòng)子的選擇性啟動(dòng)在基因表達(dá)中起重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)大約有52%的人類編碼基因含有2個(gè)或者多個(gè)選擇性啟動(dòng)子，平均每個(gè)人類編碼基因含有3.1個(gè)選擇性啟動(dòng)子［7］。最近人們對(duì)選擇性啟動(dòng)子進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)選擇性啟動(dòng)子在選擇性剪接基因調(diào)控中起到了重要的調(diào)控作用［8］。HSD11B1基因表達(dá)也是由選擇性啟動(dòng)子調(diào)控的，研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子P2在大多數(shù)組織和細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄中占主導(dǎo)地位，包括人類肝臟、皮下脂肪組織和幾種常用的細(xì)胞系如 Caco－2、C2C12 和3T3 －L1［9］。轉(zhuǎn)錄來(lái)自于 P1調(diào)控的主要出現(xiàn)在人類的腫瘤細(xì)胞，如A431和HT－29。此外，C2C12成肌細(xì)胞和3T3－L1脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中，HSD11B1基因轉(zhuǎn)錄水平增加主要來(lái)自于P2轉(zhuǎn)錄增加［9］。本試驗(yàn)應(yīng)用A549細(xì)胞系是人肺腺癌細(xì)胞系，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選擇性啟動(dòng)子P2在肺腺癌細(xì)胞中GC誘導(dǎo)HSD11B1表達(dá)過(guò)程中起主導(dǎo)作用。

此外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇和地塞米松都可以誘導(dǎo)11β－HSD1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)增加，其中皮質(zhì)醇是11β－HSD1酶氧化還原的產(chǎn)物，地塞米松是皮質(zhì)醇衍生物，兩者勻可導(dǎo)致11β－HSD1酶活性增加。研究發(fā)現(xiàn)11β－HSD1酶活性增加，可導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂易發(fā)生糖尿病、肥胖癥、高血壓、胰島素抵抗和骨質(zhì)疏松等代謝疾?。?0－14］。目前，糖皮質(zhì)激素常用于臨床疾病的治療，糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)醇和地塞米松，臨床上常用于抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒和免疫抑制作用的治療。短期(7 d以內(nèi))適量使用GC幾乎無(wú)副作用，但是長(zhǎng)期使用GC副作用明顯，會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)代謝紊亂，表現(xiàn)為新陳代謝的變動(dòng)，如血糖升高、食欲增加、體重上升、性欲減退以及極度疲勞等。長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致向心性肥胖、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)生［15－16］。綜上所述，無(wú)論是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)11β－HSD1活性增加還是糖皮質(zhì)激素本身長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)人體都有不利的影響。

本試驗(yàn)通過(guò)研究GC誘導(dǎo)HSD11B1基因表達(dá)，其選擇性啟動(dòng)子的使用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)HSD11B1表達(dá)主要經(jīng)由選擇性啟動(dòng)子P2，該結(jié)果為今后研究HSD11B1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式奠定基礎(chǔ)。

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