T細(xì)胞亞群偏移與藥物流產(chǎn)小鼠子宮出血量相關(guān)性研究＊

劉海靜 鞠紅梅 劉淑娟 王 麗 趙向忠 李 霞△

（1濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250062；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067；3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南250011）

藥物流產(chǎn)簡(jiǎn)單方便，痛苦小，臨床常廣泛應(yīng)用于終止早期妊娠；但藥流后子宮出血量多、出血時(shí)間長(zhǎng)是藥流常見(jiàn)并發(fā)癥，有報(bào)道約6%～10%的藥流病例存在異常子宮出血［1］，我們的前期研究也證實(shí)與人工流產(chǎn)術(shù)比較，藥流后子宮出血量明顯增加、出血時(shí)間顯著延長(zhǎng)［2－3］。藥流后異常子宮出血嚴(yán)重影響患者身體健康，其發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明，隨著生殖免疫學(xué)研究逐漸深入，免疫因素在其發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注。T細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，初始T淋巴細(xì)胞受到抗原刺激后，在分化誘導(dǎo)因子及特異性核轉(zhuǎn)錄因子作用下，分化為Th1／Th2／Th17／Treg亞群，產(chǎn)生特征性細(xì)胞因子，主導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)，在維持機(jī)體正常免疫功能中發(fā)揮著重要作用。已證實(shí)Th1／Th2／Th17／Treg亞群偏移參與了米非司酮（RU486）藥流的發(fā)生［4－5］，但其與藥流后子宮出血量之間的關(guān)系尚未明確。本研究以T淋巴細(xì)胞亞群為切入點(diǎn)，探討其偏移狀態(tài)與藥流后子宮出血量間的相關(guān)性，揭示藥流后異常子宮出血的發(fā)病機(jī)制。為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)BALB／C小鼠，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，10周齡，雌性小鼠未交配過(guò)，雄性小鼠證明有生育能力。置于室溫24℃，相對(duì)濕度60%～65%的超凈動(dòng)物飼養(yǎng)柜內(nèi)，給予12h光照，12h暗室，自由飲水?dāng)z食。雌、雄小鼠按2∶1比例于每日下午5：00合籠，次日清晨觀察小鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓日為妊娠第1天。將孕鼠隨機(jī)分為正常妊娠組、RU486大劑量組、RU486小劑量組，各10只，觀察各組小鼠母胎界面T細(xì)胞亞群分化狀態(tài)及子宮出血量。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 RU486（浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20000648，批號(hào)：091102）。大鼠抗小鼠熒光抗體：PC5－CD3、FITCCD4、PE－IFNγ、PE－IL－4、PE－IL－17A、PC5－CD25、PE－Foxp3（美國(guó)BD Pharmigen）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 FACSCalibur流式細(xì)胞儀（Epics XL，美國(guó)）；高速低溫離心機(jī)（Sorvall Super T21，美國(guó)）；紫外分光光度計(jì)（ND1000，美國(guó)）；超凈工作臺(tái)（SW－CJ－1F，蘇州）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，得到70%流產(chǎn)率RU486劑量1.5mg／kg／d作為大劑量，得到50%流產(chǎn)率RU486劑量0.88mg／kg／d作為小劑量［6］。自妊娠第1天開始，RU486大、小劑量組小鼠分別灌胃RU486 1.5mg／kg／d和0.88mg／kg／d，連續(xù)用藥3d。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 小鼠子宮出血量檢測(cè) 自RU486處理第1天起，小鼠陰道內(nèi)置入20g定量棉球，每日更換，4℃密閉保存，改良?jí)A性正鐵血紅素法檢測(cè)出血量［2］。

1.3.2 母胎界面T細(xì)胞亞群檢測(cè) 妊娠第11天小鼠眼球取血，拉頸處死，分離子宮組織，剪碎研磨過(guò)濾，1×PBS沖洗，密度梯度法分離單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)整為1×106個(gè)／ml，加入佛波酯30μg／L、離子霉素1mg／L、莫能霉素1.7μg／L，37℃，5%CO2孵育4h。收集細(xì)胞，加入外標(biāo)抗體（PC5－CD3、FITC－CD4；FITC－CD4、PC5－CD25），4℃避光孵育30min；BD固定穿膜試劑盒固定穿膜（按說(shuō)明書操作），加 入 內(nèi) 標(biāo) 抗 體（PE－IFNγ、PE－IL－4、PE－IL－17A、PC5－CD25、PE－Foxp3），4℃避 光 孵 育30 min；穿膜緩沖液洗2次，PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。Winmidi 2.9分析Th1（CD3＋CD4＋I(xiàn)FNγ＋）、Th2（CD3＋CD4＋I(xiàn)L－4＋）、Th17（CD3＋CD4＋I(xiàn)L－17A＋）、Treg（CD4＋CD25＋Foxp3＋）亞群占CD4＋細(xì)胞百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用One Way－ANOVA方差分析，2組間比較采用Turkey法檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson分析。

2 結(jié)果

2.1 藥流小鼠子宮出血量

與RU486小劑量組比較，RU486大劑量組藥流小鼠子宮出血量明顯減少（P＝0.000），見(jiàn)圖1。

圖1 藥流小鼠子宮出血量

2.2 RU486誘導(dǎo)小鼠母胎界面T細(xì)胞亞群偏移

與正常妊娠小鼠比較，RU486作用后小鼠子宮組織Th1、Th17亞群比例顯著升高（P＝0.008，P＝0.012），見(jiàn)圖2A，C；Th2、Treg亞群比例顯著降低（P＝0.000，P＝0.006），見(jiàn)圖2B，D；Th1／Th2比值及Th17／Treg比值顯著升高（P＝0.011，P＝0.004），見(jiàn)圖3A，B；與RU486小劑量組比較，RU486大劑量組T細(xì)胞亞群變化更明顯。

2.3 藥流小鼠T細(xì)胞亞群偏移與子宮出血量相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示藥流后子宮出血量與T細(xì)胞亞群分化狀態(tài)密切相關(guān)，其中子宮出血量與Th1、Th17亞群比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P＝0.023，P＝0.019），與Th2、Treg亞群比例呈顯著正相關(guān)（P＝0.005，P＝0.011），與Th1／Th2比 值、Th17／Treg比值呈顯著負(fù)相關(guān)（P＝0.000，P＝0.010），見(jiàn)圖4。

圖2 RU486對(duì)小鼠子宮組織T細(xì)胞亞群的影響

圖3 RU486對(duì)小鼠子宮組織Th1／Th2、Th17／Treg比值的影響

圖4 T細(xì)胞亞群偏移與子宮出血量相關(guān)性

3 討論

藥物流產(chǎn)是終止非意愿早期妊娠的重要措施，因其簡(jiǎn)單方便、痛苦小的優(yōu)點(diǎn)而被患者廣泛接受，但藥流后異常子宮出血一直是臨床難以解決的問(wèn)題。由于藥流后異常子宮出血的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，導(dǎo)致缺乏作用靶點(diǎn)明確、臨床療效滿意的減輕藥流后子宮出血藥物。因此，對(duì)藥流后異常子宮出血發(fā)病機(jī)制及防治的一直是婦產(chǎn)科領(lǐng)域與生殖免疫領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。從免疫學(xué)角度，正常妊娠類似成功的半同種異體移植，母胎之間通過(guò)精細(xì)而復(fù)雜的免疫調(diào)控誘導(dǎo)并維持母胎免疫耐受狀態(tài)。T細(xì)胞在母胎免疫耐受形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，初始T細(xì)胞在MHC－抗原肽復(fù)合物的刺激下，分化為Th1／Th2／Th17／Treg亞群，產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮不同作用。Th1、Th2是經(jīng)典的T細(xì)胞亞群，Th1亞群可分泌特異性細(xì)胞因子IL－2、IFN－γ誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，其過(guò)度表達(dá)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生；Th2亞群可分泌特異性誘導(dǎo)免疫耐受的細(xì)胞因子IL－4、TGF－β，使胚胎逃離母體免疫排斥，利于妊娠維持［7］。妊娠時(shí)Th1／Th2平衡向Th2偏移誘導(dǎo)母胎免疫耐受狀態(tài)［8］，Th1類細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)則打破母胎免疫耐受而導(dǎo)致流產(chǎn)［9］。隨著免疫學(xué)研究的不斷深入，相繼發(fā)現(xiàn)兩種新T細(xì)胞亞群Th17、Treg，從而將Th1／Th2模式擴(kuò)展為Th1／Th2／Th17／Treg模式。Th17細(xì)胞的分化由TGFβ和IL－6共同誘導(dǎo)，Th17細(xì)胞分泌大量的IL－17A、IL－17F、IL－21等細(xì)胞因子，通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)清除Th1和Th2細(xì)胞免疫無(wú)法處理的特定病原體，但其過(guò)度表達(dá)則可導(dǎo)致炎癥損傷［10］。Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞來(lái)源于同一祖細(xì)胞，其分化過(guò)程主要由TGF－β誘導(dǎo)。Treg產(chǎn)生IL－10、TGF－β等抑制性細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答強(qiáng)度、維持免疫耐受中扮演著重要角色［11］。已證實(shí)正常妊娠狀態(tài)Th17／Treg平衡向Treg偏移［12］，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型動(dòng)物及患者存在Th17／Treg平衡向Th17偏移現(xiàn)象［13］。

隨著生殖免疫學(xué)研究的不斷深入，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受在妊娠及妊娠相關(guān)疾病中的作用日益受到關(guān)注。RU486是藥物流產(chǎn)主要藥物，發(fā)現(xiàn)RU486在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合孕激素受體、阻斷孕激素作用的同時(shí)，對(duì)免疫系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用。臨床研究證實(shí)，RU486藥流婦女血清及蛻膜組織中Th1類細(xì)胞因子表達(dá)升高、Th2類細(xì)胞因子表達(dá)降低［14］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RU486作用后，妊娠小鼠母胎界面IL－17表達(dá)升高，IL－10、TGF－β表達(dá)降低，提示RU486誘導(dǎo)了Th17亞群偏移［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠小鼠相比，RU486藥物流產(chǎn)小鼠母胎界面T細(xì)胞向Th1、Th17亞群偏移，且RU486大劑量組效果更明顯，證實(shí)RU486誘導(dǎo)T細(xì)胞亞群偏移是其藥流作用機(jī)制之一。與RU486小劑量組比較，RU486大劑量組小鼠子宮出血量明顯減少；以此同時(shí)，相關(guān)性分析顯示RU486藥物流產(chǎn)小鼠子宮出血量與T細(xì)胞亞群偏移狀態(tài)密切相關(guān)，子宮出血量與Th1、Th17亞群比例及Th1／Th2、Th17／Treg比值呈顯著負(fù)相關(guān)，與Th2、Treg亞群比例呈顯著正相關(guān)。以上研究結(jié)果提示T細(xì)胞亞群偏移在RU486藥流中扮演著重要角色，T細(xì)胞亞群偏移狀態(tài)與流產(chǎn)效果及子宮出血量密切相關(guān)，靶向誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1、Th17亞群偏移、誘導(dǎo)母胎免疫排斥的方法可能成為減輕藥流后子宮出血的有效途徑。

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