急性精神應激對SD大鼠部分腦區(qū)BDNF及CREB表達的影響

李功迎 馬洪霞

（濟寧醫(yī)學院山東省行為醫(yī)學重點實驗室；濟寧醫(yī)學院護理學院，山東 濟寧272067）

隨著社會競爭的日益劇烈，應激（或稱壓力，stress）無處不在。應激分為生理應激（也稱軀體應激）和心理應激（也稱精神應激）。目前，精神應激對于個體而言是更有意義、更值得研究的問題，因為這種應激普遍存在于我們的現(xiàn)實生活中，而包含對軀體刺激的生理應激或純粹的軀體應激不能很好地模擬現(xiàn)實生活中人類所面臨的心理壓力或應激［1］。正如一些人目睹了一些應激事件（如目睹車禍、恐怖事件等），本身未經(jīng)受任何軀體損傷，但過后一部分人會出現(xiàn)心理或精神障礙。

大量研究證明，機體處于應激狀態(tài)時，可以引起一系列神經(jīng)生化、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的變化，影響機體內(nèi)環(huán)境的平衡，引起器官功能改變，也會導致機體產(chǎn)生腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性改變［2－5］。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain－derived neurotrophic factor，BDNF）作為一種對多種神經(jīng)元具有促進分化和再生、增強功能表達及營養(yǎng)、支持、保護作用的堿性蛋白［4］，最近有證據(jù)表明BDNF與應激、突觸可塑性密切相關(guān)。但其在精神應激中具體發(fā)揮了什么樣的作用？其發(fā)揮作用的機制是什么？這些問題尚不清楚。

本文選取“旁觀電擊大鼠應激模型（Communication Box）”［1，6］這一被認為“純精神應激”的模型，通過采用免疫組化技術(shù)，觀察精神應激后海馬CA1區(qū)、前額葉皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）、杏仁核中央核（central amygdaloid nuclei，AG）、伏隔核（殼區(qū)）（shell of accumbens nucleus，NAC）、中腦導水管周圍灰質(zhì)（periaqueductal gray，PAG）、腹側(cè)背蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）內(nèi)BDNF、CREB不同時點表達的可塑性變化，探討B(tài)DNF對精神應激有無保護作用，以及其保護作用是否通過激活CREB途徑實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠，由中南大學湘雅二醫(yī)院動物實驗中心提供，進入實驗時的體重為180～220g。實驗動物于實驗開始前一周，飼養(yǎng)于晝夜節(jié)律12／12h（8AM～8PM）、通風良好的動物房。環(huán)境溫度控制在22～24℃，動物均能自由飲水和進食。

1.2 實驗器材

旁觀電擊大鼠應激箱（Communication Box）［1，6］：箱子規(guī)格為60cm×60cm×44cm（長×寬×高），箱子四壁由木板做成，其“地板部分”由平行的不銹鋼柱（直徑：5mm；相鄰兩個不銹鋼柱的圓心之間的距離為1cm）組成，這些不銹鋼柱與220V電源相連，加一可變電阻，保證電流為1.5～2.2mA，并有一手控裝置，能隨時中斷或接通電源。箱內(nèi)由比較堅硬透明的有機玻璃平均分成9個相同的單元格，每個單元格長×寬×高為20cm×20cm×44cm，箱內(nèi)每個有機玻璃板距離“地板”6cm處有一直徑2cm圓孔。最中間單元格內(nèi)的地板是通電的，其內(nèi)放置的SD大鼠，接受電擊，為生理應激鼠（senders rat），最中間單元格的四周單元格的地板是絕緣的，其內(nèi)放置的SD大鼠，不接受電擊，而是旁觀生理應激鼠遭受電擊的過程，通過視覺、聽覺、味覺等而產(chǎn)生精神應激，稱為精神應激鼠（responders rat）。精神應激鼠本身在軀體上不接受電擊，軀體沒受到任何損傷，因此這個模型可以較好地用來研究精神應激問題。

1.3 實驗方法

共分為2組：精神應激組（PS組）、空白對照組（Control組）。精神應激組（PS組）根據(jù)觀察的時間點分為應激后即刻、應激后0.5h、1h、2h、6h、24h 6小組，每組6只SD雄性大鼠，均為隨機分組。另有5只老鼠用來交替作生理應激鼠，共47只鼠。

1.3.1 應激方法 在旁觀電擊大鼠模型箱內(nèi)，生理應激組大鼠接受電擊，電流為1.5～2.2mA，周期5s，間歇55s，產(chǎn)生驚叫、驚跳、大小便失禁等反應；精神應激組不接受電擊，而是旁觀生理應激鼠遭受電擊的過程，通過視覺、聽覺、味覺等產(chǎn)生精神應激。每次應激在上午8∶00—9∶00進行，每次持續(xù)1h，每日1次，共進行2d。而空白對照組不接受任何應激。

1.3.2 動物處理 每組接受應激后，根據(jù)時間點，腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg／kg體重）麻醉，胸腹腔聯(lián)合切開，暴露心臟，經(jīng)左心室插管于升主動脈，剪開右心耳，先用無菌生理鹽水150ml快速灌注，直至流出液清亮。然后用4%多聚甲醛250ml以先快后慢原則灌注固定30min，取腦并將腦組織置于相同固定液中后固定2h（4℃），再放入30%蔗糖液中直至沉底。恒冷冰凍切片機－20℃下連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，參照大鼠解剖圖譜，留取含海馬CA1區(qū)、PF、AG、NAC、PAG、VTA等以上各腦區(qū)的切片。

1.3.3 免疫組化 本研究中免疫組化均是按ABC法進行，具體的試驗步驟：1%H2O2處理切片30min，0.01MPBS漂洗5min×3次，室溫下正常山羊血清封閉1h并振蕩，分別加相應一抗（BDNF一抗工作液濃度為1／1000；磷酸化CREB一抗工作液濃度亦為1／1000），4℃孵育過夜。0.01M PBS漂洗5min×3次，分別加生物素化的二抗（1／100），2h后0.01MPBS漂洗5min×3次。加ABC復合物（1／100），室溫下反應2h，0.01MPBS漂洗5min×3次，DAB顯色（DAB 0.03%，H2O20.01%，0.01MPBS配制），顯微鏡下控制反應，顯色滿意后0.01MPBS充分漂洗終止反應。貼片，常規(guī)脫水透明、中性樹膠封片。陰性對照是以正常山羊血清取代一抗，其余步驟不變。

1.4 圖像分析

每組每只動物隨機選取含有各靶區(qū)的原位雜交染色切片與免疫組織化學染色切片各4張，每張切片隨機選取4個視野。使用Motic病理圖像分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）測量陽性神經(jīng)元的平均灰度值。切片陽性區(qū)表達的強弱與灰度值呈負相關(guān)，灰度值大則陽性表達弱，反之亦然。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有的試驗結(jié)果除非特殊說明，均以±s表示。多組均數(shù)間的比較，采用方差分析（ANOVA），兩均數(shù)之間的比較采用獨立樣本t檢驗。所有的統(tǒng)計分析均采用SPSS11.5軟件包完成。

2 結(jié)果

2.1 精神應激組BDNF在各被檢腦區(qū)內(nèi)不同時點的表達

由圖1A－F可看出，精神應激后即刻各腦區(qū)BDNF表達明顯下調(diào)，灰度值明顯大于對照組，差異具有極顯著性；精神應激后0.5h、1hBDNF表達開始恢復，但仍少于對照組，差異有顯著性；精神應激后2hBDNF表達除VTA區(qū)外，其余各腦區(qū)恢復至對照組水平，兩組比較無明顯差異；精神應激后6hBDNF表達繼續(xù)增高，明顯高于對照組（VTA區(qū)除外），差異有顯著性；精神應激后24h BDNF mRNA表達達最高值，明顯高于對照組，差異有顯著性（VTA區(qū)除外，VTA區(qū)表達仍低于對照組）。

圖1 應激后不同時刻精神應激組與正常對照組BDNF蛋白在各腦區(qū)表達的灰度值

2.2 精神應激組磷酸化CREB在各被檢腦區(qū)內(nèi)不同時點的表達

由圖2可看出，在應激后即刻，精神應激組CREB灰度值較對照組明顯增大，差異具有顯著性，說明應激后即刻精神應激組CREB明顯低表達，較對照組表達明顯減少。隨后表達逐漸增多，精神應激后24h時，精神應激組CREB灰度值較對照組明顯減小，差異具有顯著性，說明應激后24h時，精神應激組CREB明顯高表達，較對照組表達明顯增多。

圖2 免疫組化檢測精神應激組P－CREB在各被檢腦區(qū)內(nèi)不同時點的表達

2.3 精神應激后BDNF與CREB的相關(guān)分析

將精神應激后即刻、精神應激后24h各對應腦區(qū)BDNF與CREB灰度值作相關(guān)分析，精神應激后即刻BDNF蛋白與P－CREB作Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者明顯相關(guān)（P均＜0.05）；精神應激后24hBDNF蛋白與P－CREB作Pearson相關(guān)分析，亦發(fā)現(xiàn)兩者明顯相關(guān)（P均＜0.05）；說明二者存在明顯時空相關(guān)性。見表1。

表1 精神應激后各對應腦區(qū)BDNF與CREB的Pearson相關(guān)分析（數(shù)值均為相關(guān)系數(shù)）

3 討論

既往有關(guān)應激后BDNF表達的研究較多，但本研究不同于之前的研究。首先，本研究是采用旁觀電擊大鼠應激模型研究精神應激鼠BDNF的表達；其次，本研究采用免疫組織化學技術(shù)同時探討了大腦多部位、多腦區(qū)不同時點的BDNF的表達，即BDNF的時空表達。本研究發(fā)現(xiàn)，精神應激后即刻BDNF蛋白表達明顯下調(diào)，與對照組比較差異有極顯著性；精神應激后0.5h、1hBDNF表達開始恢復，但仍少于對照組，差異有顯著性；精神應激后2hBDNF表達恢復至對照組水平，兩組比較無明顯差異；精神應激后6hBDNF表達繼續(xù)增高，明顯高于對照組，差異有顯著性；精神應激后24h BDNF表達達最高值，明顯高于對照組，差異有極顯著性。以上結(jié)果說明，首先精神應激確實對機體造成了損傷，應激后即刻BDNF的表達明顯減少；其次，精神應激后不同時間，BDNF在逐漸恢復，2h時恢復至對照水平，其后仍逐漸增高，至24h時達最大值。精神應激時BDNF的這種快速表達及快速翻譯成蛋白，支持BDNF參與了應激反應的觀點［7］，同時，考慮到BDNF具有對多種神經(jīng)元有促進生存、分化、再生、增進代謝、增強功能表達、營養(yǎng)、支持、保護及增強突觸可塑性［8］的作用，BDNF在精神應激后的表達增多，說明BDNF在精神應激中發(fā)揮了保護作用。這種保護作用的發(fā)揮，可能就是通過BDNF表達的上調(diào)發(fā)揮其修飾樹突生長，增強突觸效能，調(diào)節(jié)應激環(huán)路的組織、功能和反應性等功能實現(xiàn)的［9］。BDNF的表達能在這么短的時間內(nèi)恢復并增加，一方面說明機體對精神應激有自身保護作用，另一方面說明BDNF參與了機體精神應激狀態(tài)下的“異穩(wěn)態(tài)平衡”，個體正是通過這種“異穩(wěn)態(tài)平衡”來盡快擺脫或戰(zhàn)勝應激原以使“內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡”恢復，使機體不出現(xiàn)外顯的異常狀態(tài)。

BDNF發(fā)揮保護作用的可能機制又是如何呢？BDNF要發(fā)揮保護作用，首先要與其受體trkB結(jié)合，結(jié)合后誘導受體二聚化，繼而通過酪氨酸殘基自身磷酸化激活該酶的活性區(qū)。受體的酪氨酸位點磷酸化后能激活許多下游信號通路，如Ras－MAPK級聯(lián)，磷脂酰肌醇激酶（PI－3K）通路及磷脂酶C（phospholipase C，PLC）級聯(lián)［10］?？赡艿耐肥荝as－MAPK通路。Ras是第1個被激活的信號轉(zhuǎn)導蛋白－小GTP結(jié)合蛋白Ras，激活的Ras引起C－raf結(jié)合到質(zhì)膜，并在Ser217和Ser221位點磷酸化MEK1（MAPK的激酶），引起ERK1／2（extra cellular signal－related protein kinase）的 磷酸化，ERK1／2激活RSK后，RSK在Ser133磷酸化CREB，使其與CBP（CREB結(jié)合蛋白）結(jié)合，由此產(chǎn)生擴大的轉(zhuǎn)錄信號刺激Bcl－2的激活，Bcl－2為一種抗凋亡蛋白?？梢娫撏肥峭ㄟ^刺激抗凋亡蛋白的表達，從而發(fā)揮保護作用。該通路可簡單描述為BDNF＋trkB→Ras→MEK1→MAPK→ERK1／2→P－CREB→Bcl－2。由此通路可看出BDNF可以通過多種信號級聯(lián)激活CREB，CREB再進而放大信號，從而發(fā)揮保護作用。本文發(fā)現(xiàn)精神應激后即刻P－CREB明顯減少，應激后24h時較對照又明顯增多，BDNF的時空表達和CREB的時空表達兩者是一致的；并且發(fā)現(xiàn)精神應激后即刻和精神應激后24hBDNF和P－CREB及二者mRNA對應腦區(qū)的灰度值都存在明顯正相關(guān)。本研究結(jié)果也驗證了以上提出的通路假設(shè)。Conti等［11］通過對CREB基因突變鼠和野生鼠的研究亦發(fā)現(xiàn)，BDNF的時空表達和CREB的活動是互相平行的，與本研究結(jié)果類似。

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