絞股藍(lán)對2型糖尿病大鼠腎臟組織中MMP-9與TIMP-1表達(dá)的影響※

郎志芳 劉蘭濤 王洪偉 吳 琦

絞股藍(lán)對2型糖尿病大鼠腎臟組織中MMP-9與TIMP-1表達(dá)的影響※

郎志芳 劉蘭濤 王洪偉 吳 琦

目的觀察絞股藍(lán)對2型糖尿病大鼠腎臟的組織（TIMP-1）金屬蛋白酶組織抑制物1、(MMP-9)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響。方法建立2型糖尿病大鼠模型，分為糖尿病組，絞股藍(lán)高、中、低劑量組。給藥 6 周后，應(yīng)用免疫組化方法檢測各組大鼠腎臟的組織中TIMP-1、MMP-9的表達(dá)情況。結(jié)果糖尿病組TIMP-1明顯增高、而 MMP-9的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；絞股藍(lán)治療組隨著劑量的增加TIMP-1逐漸降低、 MMP-9逐漸增高（P均＜0.01）。結(jié)論絞股藍(lán)對2型糖尿病大鼠腎臟纖維化有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過下調(diào)大鼠腎組織TIMP-1 和上調(diào)MMP-9的表達(dá)來實現(xiàn)的。

絞股藍(lán)；2 型糖尿病；MMP-9；TIMP-1

糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy, DN）是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要原因。糖尿病腎病的主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚和腎小球基底膜增厚。ECM積聚主要是由于ECM產(chǎn)生增多和降解障礙所致，而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制劑金屬蛋白酶組織抑制物（TIMPs）在ECM合成和降解的生理平衡中起重要作用。

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino）又名七葉膽公羅鍋底，葫蘆科多年生攀緣草質(zhì)藤本植物，研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)具有抗腫瘤，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，降低血脂，心血管保護(hù)等多種生物活性。絞股藍(lán)多糖是其主要活性成分。本研究采用免疫組化方法觀察絞股藍(lán)對2型糖尿病大鼠腎臟組織TIMP-1和MMP-9表達(dá)情況的影響，旨在探討絞股藍(lán)對2型糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 材料絞股藍(lán)顆粒由牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院制劑室提供，兔抗大鼠MMP-9、TIMP-1一抗購于武漢博士德生物工程有限公司；STZ 購自Sigma公司，二抗和DAB試劑盒購自北京中山金橋有限公司；PAS染色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實驗動物雄性 Wistar 大鼠，6～8周齡，體重180g左右，由牡丹江醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組參照劉云[1]和Masiello P[2]方法，將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，正常對照組和絞股藍(lán)高、中、低劑量治療組和2型糖尿病模型組。除正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組給予高糖高脂飼料，并于第四周腹腔注射STZ（按40mg/kg），并繼續(xù)給予高糖高脂飼料，制備2型糖尿病大鼠模型。72h后尾靜脈采血測定空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥16.65mmol/L者判為造模成功。糖尿病模型組繼續(xù)給予高糖高脂飼料。絞股藍(lán)干預(yù)低、中、高劑量組除給予高糖高脂飼料外，分別灌胃給予絞股藍(lán)50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg，正常組和模型組灌服生理鹽水。

1.3.2 空腹血糖測定空腹血糖（FBG）的測定，應(yīng)用三諾 SXT 1 活力型血糖測試儀，從尾尖采血測定。

1.3.3 取材及冰凍切片免疫組化絞股藍(lán)治療6周后，取大鼠腎臟，4%甲醛固定。冰凍包埋，切片，冷丙酮固定后，分別滴加兔抗大鼠TIMP-1和MMP-9一抗，4℃過夜，pbs清洗5分鐘，滴加二抗，37℃溫育60min，DAB顯色，封片。測定每個高倍鏡視野中陽性細(xì)胞光密度和面密度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)表示用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

絞股藍(lán)對糖尿病大鼠腎臟組織中MMP-9、TIMP-1表達(dá)情況的影響。

正常對照組大鼠腎臟組織中，MMP-9表達(dá)量高而TIMP-1表達(dá)較少，糖尿病模型組中TIMP-1則明顯增強(qiáng)和MMP-9表達(dá)明顯減少（P＜0.01），而絞股藍(lán)治療組的TIMP-1和MMP-9表達(dá)介于正常對照組和糖尿病模型組之間（P＜0.05，表1）。

表1 各組腎組織MMP-9、TIMP-1數(shù)密度值的比較[n,(±s)]

表1 各組腎組織MMP-9、TIMP-1數(shù)密度值的比較[n,(±s)]

注：各模型組相比較*P＜0.05，**P＜0.01

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3 討論

糖尿病腎病的主要病理改變是腎小球ECM沉積，主要原因是 ECM的產(chǎn)生過多或降解障礙，引起腎小球結(jié)構(gòu)破壞和腎小球硬化，ECG由層粘連蛋白、Ⅳ型膠原纖維、連接蛋白等組成。研究表明，糖尿病腎病的發(fā)病過程中，常常伴有細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解異常，而 MMP-9及其 TIMP-1在細(xì)胞外基質(zhì)代謝中起重要作用。 MMP-9是調(diào)節(jié)ECM組成的重要的一種酶。MMP-9經(jīng)過催化劑催化變?yōu)橛谢钚缘腗MP-9，MMP-9與系膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及纖溶酶原積極結(jié)合釋放出纖溶酶，調(diào)解ECG的降解。

TIMP-1是特異性內(nèi)源性抑制因子，TIMP-1能夠封閉 MMP-9的活性中心，使MMP-9失活，使ECM降解受抑制，有學(xué)者研究表明，MMP-9/ TIMP-1 表達(dá)失衡在糖尿病腎病中發(fā)揮了重要的作用。TASHIRO等研究證實，MMP-9 和Ⅳ型膠原均在糖尿病腎病中顯著升高。QI W等[3]研究發(fā)現(xiàn)系膜細(xì)胞在高糖環(huán)境中培養(yǎng)使MMP-9 表達(dá)增加而TIMP-1 表達(dá)減少。

絞股藍(lán)具有益氣健脾、養(yǎng)心安神、滋陰益腎、消痰化瘀的作用。其化學(xué)成分主要為絞股藍(lán)皂苷和絞股藍(lán)多糖類等多種成分。張永等[4]研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)可通過多個環(huán)節(jié)干預(yù)糖尿病腎病發(fā)病。本課題組先期研究發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷通過降血脂、抗氧化、抗動脈硬化等作用，對糖尿病腎病起到保護(hù)作用。本實驗顯示，糖尿病模型組大鼠腎臟組織中MMP-9的表達(dá)明顯降低，而TIMP-1的表達(dá)明顯升高，促使ECM在糖尿病大鼠腎小球內(nèi)的積聚，導(dǎo)致腎小球病變，糖尿病腎病的發(fā)病。絞股藍(lán)可以調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1的病態(tài)平衡，上調(diào)MMP-9和下調(diào)TIMP-1的表達(dá)，促進(jìn)ECM的降解，從而對糖尿病腎病起到保護(hù)作用。

[1] 劉云,陳雋.不同糖代謝異常大鼠動物模型的建立[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(15)：1804-1807.

[2] Masiello P, Broca C, Gross R, et al. Experimental NIDDM：development of a new model in adult rats administered streptozotocin and nicotinamide[J]. Diabetes, 1998,47(2)：224-229.

[3] QI W, Poronnik P, Young B, et al. Human cortical fibroblast responses to high glucose and hypoxia[J]. Nephron Physiol, 2004, 96(4)：121-129.

[4] 張永,張建鄂,吳平勇,等.絞股藍(lán)總甙與纈沙坦治療早期糖尿病腎病的對比研究[J].鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,26(4)：199-200.

R963

A

1673-5846(2013)06-0201-02

黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011

牡丹江醫(yī)學(xué)院科研項目（編號B200805）

劉蘭濤，郵箱：llt7076@163.com。