木棉葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化研究

曾小平 單桂根 陳小銳

木棉葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化研究

曾小平 單桂根 陳小銳

目的確定木棉葉總黃酮的最佳提取工藝條件。方法采用分光光度法，以槲皮素為標準品測定木棉葉中的總黃酮含量，在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過正交實驗對木棉葉總黃酮提取工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果確定木棉葉總黃酮的最佳提取工藝為取70目的藥材加入20倍量的80%乙醇回流1h，該提取工藝的總黃酮得率為25.172mg/g。結(jié)論本提取工藝具有簡單、可靠、準確的特點，可作為木棉葉總黃酮的最佳提取工藝。

木棉葉；總黃酮；工藝條件

木棉Gossampinus malabaria（DC.）Merr為木棉科木棉屬的植物，原產(chǎn)地為中國、越南、緬甸、印度等地。研究表明，木棉的主要化學(xué)成分為揮發(fā)性成分、三萜及黃酮類化合物，藥理活性主要有抗菌、抗炎、抗腫瘤及肝損傷保護等[1]。在木棉葉中分離出具有一定活性的黃酮類化合物，其中具有代表性的是槲皮素[2-3]。目前尚未見對木棉葉總黃酮提取工藝的報道，故本研究將在單因素實驗的基礎(chǔ)上通過正交設(shè)計實驗對木棉葉總黃酮提取工藝條件進行優(yōu)化，為今后開發(fā)利用木棉葉總黃酮作鋪墊和參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗原料木棉葉：廣東翁源縣出品。

1.2 實驗儀器和主要試劑S22PC分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯）；DFY-300搖擺式中藥粉碎機（中國浙江溫嶺市林大機械有限公司）；KQ-200VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；槲皮素對照品（100081-201106）；乙醇等均為分析純。

2 實驗方法

2.1 樣品處理木棉樹葉陰干，稱取100g粉碎過篩網(wǎng)，置500ml錐形瓶中，加入200ml石油醚（60～90℃）攪拌搖勻后，靜置過夜，濾紙過濾，粉末50℃烘干，備用。

2.2 標準品溶液的制備精密稱取在105℃干燥至恒重的槲皮素對照品25.05mg，置100ml容量瓶中，加入80%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度0.2505mg/ml的槲皮素標準溶液。

2.3 最大波長的選擇精密吸取2.1中配制好的標準品5ml于50ml量瓶中，加入80%乙醇定容至刻度，在200～800nm進行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在360nm處有最大吸收，所以選擇360nm為測量波長。

2.4 標準曲線的測定精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml置于50ml量瓶中，加入80%乙醇定容至刻度。在最大波長360nm處，以槲皮素濃度（x）對吸光度（y）繪制標準曲線。結(jié)果表明，槲皮素溶液濃度在0.005～0.030mg/ml內(nèi)，濃度（x）與吸光度（y）之間呈良好的線性關(guān)系，如圖1。

圖1 槲皮素標準曲線

2.5 樣品總黃酮含量測定精密量取樣品黃酮提取液10ml，置50ml容量瓶中，并加入PH=3.0的HCl溶液5ml與80%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10min，在波長360nm下測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算提取液中總黃酮含量?？傸S酮得率以1g原料中總黃酮的含量（mg）計算。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗

3.1.1 不同倍量溶劑的選擇精密稱取2.1中處理的木棉葉干粉末3g，放入250ml的圓底燒瓶中，加入80%乙醇（5倍量、10倍量、15倍量、20倍量、25倍量、30倍量），在80℃水浴回流中提取2h，后用濾紙過濾，濾液待用。按2.5中方法測定總黃酮含量。由圖2可知，溶劑用量10～15倍時黃酮得率相對較高，當15倍量時總黃酮得率最高。

圖2 提取溶劑倍量對總黃酮的影響

3.1.2 不同乙醇濃度的選擇按15倍量加入乙醇，濃度變量（50%、60%、70%、80%、90%），其余操作同3.1.1中方法。由圖3可見，乙醇濃度為70%～90%時對黃酮得率的影響明顯，當80%乙醇時總黃酮得率最高。

圖3 乙醇濃度對提取效果的影響

3.1.3 不同回流時間的選擇按15倍量加入乙醇，回流時間變量為（1、2、3、4、5h），乙醇濃度為80%，其余操作同3.1.1中方法。由圖4可見，回流時間對總黃酮得率的影響不明顯，但當回流時間為2h時總黃酮得率最高。

圖4 回流時間對提取效果的影響

3.1.4 不同粉碎粒度的選擇藥材粉碎時采用不同型號的篩網(wǎng)（50、60、70、80、100目），過篩后分別按15倍量加入濃度為80%乙醇，回流時間為2h，其余操作同3.1.1中方法。由圖5可見，不同藥材粉碎粒度對黃酮得率的影響明顯，當粉碎粒度為70目時總黃酮得率最高。

圖5 不同粉碎粒度對提取效果的影響

3.2 正交實驗根據(jù)單因素試驗選擇各因素主要影響水平，回流溫度（A）、回流時間（B）、提取溶劑倍量（C）和乙醇濃度（D）進行L9（34）正交實驗（各因素水平及結(jié)果見表1、2）。

表1 正交實驗因素和水平

表2 木棉葉總黃酮提取工藝優(yōu)化L9(34)正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 木棉葉總黃酮提取工藝優(yōu)化方差分析結(jié)果

從表2結(jié)果可知，各因素影響的主次順序為乙醇濃度＞回流溫度＞加入乙醇倍量＞回流時間。表3方差分析結(jié)果顯示，最佳提取工藝為A2B3C3D2，即取70目的藥材加入20倍量的80%乙醇回流5h。

3.3 工藝驗證提取時間越長，黃酮類物質(zhì)浸出提取越完全，但隨著時間的延長雜質(zhì)浸出同時也增多，且黃酮長期處于高溫溶液中易被氧化，回流時間對總黃酮得率的影響并不明顯，所以進行工藝驗證時選擇回流時間分別為1h和5h，即按A2B3C3D2和A2B1C3D2兩種工藝條件提取黃酮，平行測定3份進行對比。結(jié)果表明，兩種工藝條件總黃酮得率平均分別為25.176mg/g、25.172mg/g。本著節(jié)約成本的原則，確定木棉葉總黃酮的最佳工藝為A2B1C3D2，即加入20倍量的80%乙醇在70℃水浴回流1h。

4 討論

本實驗通過單因素考查和正交實驗結(jié)合工藝驗證確定了木棉葉總黃酮的最佳提取工藝，取70目的藥材加入20倍量的80%乙醇回流1h。本提取工藝具有簡單、穩(wěn)定、準確的特點。在單因素實驗中，可得出提取時間對總黃酮的提取率影響不明顯，從考慮到節(jié)約成本和工藝簡單化的情況下進行工藝驗證，確定了最佳的提取時間為1h。根據(jù)相關(guān)研究報道[4-5]，木棉葉的總黃酮主要以黃酮苷的形式存在，所以在總黃酮的提取過程中，加入適量的酸水可使其水解。植物中所含的色素往往對吸收峰有干擾，所以有必要去除一部分色素，采用石油醚萃取法可去除木棉葉中的絕大部分色素[6]，對回流提取法具有實用性、安全性及簡單性，在實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中更能體現(xiàn)其設(shè)備要求低、簡便、成本低廉的特點。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典·上冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1975：364.

[2] 齊一萍,郭舜民.木棉的化學(xué)成分與藥理作用研究[J].福建醫(yī)藥雜志,2002,24(3)：119.

[3] 王國凱,林彬彬,劉欣欣,等.木棉葉酚性成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2012,24(03)：336-338,341.

[4] 劉欣欣,王國凱,秦民堅.紫外分光光度法測定木棉葉中總黃酮的含量[J].中國野生植物資源,2011,30(06)：70-72.

[5] 周麗.葛根異黃酮的提取、純化及水解工藝的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[6] 崔旭海.銀杏葉黃酮類化合物提取分離技術(shù)的研究進展[J].食品工程,2008(4)：7-11.

Study on Optimum Process for Extraction of Total flavonoids from Gossampinus Malabaria Leaf

Zeng Xiaoping Shan Guigen Chen Xiaorui

ObjectiveTo determine the optimum extraction condition of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf.MethodsIn this study,one-factor and orthogonal array design methods were used to optimize of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf. The determination of total flavonoids was spectrometrically carried out using quercetin as the reference standard.ResultsThe optimal conditions for extracting total flavonoids from gossampinus malabaria leaf were 20 times the amount of ethanol, 80% ethanol as the extraction solvent, extraction time 1h, and 70 mesh crushed.The total flavonoids with the extraction process was 25.172mg/g.ConclusionThe extraction method is simple, rliable, and accurate, which can be used as the optimum extraction conditions of total flavonoids from gossampinus malabaria leaf.

Gossampinus malabaria leaf; Total flavonoids; Extraction condition

R284.2

A

1673-5846(2013)06-0033-03

清遠市食品藥品檢驗所，廣東清遠 511517