紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地山楂果實(shí)中總黃酮含量※

馬燕斌 曾建勛 張俊鵬 李瑞明 劉 怡 梁耀榮

紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地山楂果實(shí)中總黃酮含量※

馬燕斌 曾建勛 張俊鵬 李瑞明 劉 怡 梁耀榮

目的建立紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地山楂果實(shí)中總黃酮含量。方法采用超聲法提取山楂果實(shí)中的總黃酮，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地山楂總黃酮含量，檢測(cè)波長(zhǎng)為500nm。結(jié)果蘆丁在質(zhì)量濃度20～120μg/mL（r=0.9993）范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好，平均回收率為100.1%，RSD=0.3%（n=6），來(lái)自8個(gè)產(chǎn)地的總黃酮含量在3.53%～4.12%之間。結(jié)論本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可快速測(cè)定山楂果實(shí)中總黃酮的含量；不同產(chǎn)地山楂總黃酮的含量存在一定差異，本實(shí)驗(yàn)可為控制山楂的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

山楂；總黃酮；紫外-可見(jiàn)分光光度法

山楂為薔薇科山楂屬植物，主要分布在北半球溫帶亞洲、歐洲、美洲各州，目前已有1000多種山楂種屬被鑒定[1]。在亞洲、歐洲、美洲，人們廣泛食用山楂的提取物作為食品和膳食補(bǔ)充劑。在北美，尤其是加拿大，山楂提取物可能有助于與心臟相關(guān)疾病的治療[2]。許多研究表明，山楂的葉、花和果實(shí)的提取物對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生有益的影響，具有保護(hù)心血管，舒張血管內(nèi)皮依賴性血管[3]，改善冠脈循環(huán)[4]，降血脂的作用[5]。中國(guó)的山楂也具有舒張血管[6]和降血脂的作用[7-8]。

在中國(guó)和歐洲，山楂被廣泛用于食品和藥品生產(chǎn)中，如酒、果醬和大山楂[9]。目前，市場(chǎng)上銷(xiāo)售的山楂藥品已有七大類(lèi)70余種，除用于消積化食、補(bǔ)脾健胃之外，也用于防治心血管疾病。山楂制劑的安全性研究發(fā)現(xiàn)，常見(jiàn)的不良反應(yīng)有頭暈、胃腸道反應(yīng)、心慌等，但并未有嚴(yán)重的影響[10-11]。而山楂中的主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物，如金絲桃苷、槲皮素、原花青素[12-13]。由于生長(zhǎng)的環(huán)境不同，不同產(chǎn)地山楂的質(zhì)量不同。因此，對(duì)山楂中總黃酮的含量進(jìn)行研究是必要的，本研究對(duì)不同產(chǎn)地的山楂果實(shí)中總黃酮的含量進(jìn)行研究，為綜合評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地山楂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑主要儀器：SB25-12D臺(tái)式超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UV/VIS916型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津公司）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；電子分析天平（Sartorius公司）。

1.2 試劑與材料蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)100080-200707）；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；山楂果實(shí)采自9～10月，產(chǎn)地分別為山東棗莊、安徽蕪湖、山西晉城、河南新鄉(xiāng)、河南林州、河南南陽(yáng)、河北承德、廣西桂林、遼寧遼陽(yáng)、云南昆明。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)地山楂果實(shí)中總黃酮的提取先將山楂粉碎后過(guò)10目篩，按十字交叉法取樣，精密稱取山楂粉末三份，每份5.0g，分別加入70%乙醇100mL，超聲提取40min，重復(fù)提取2次。提取完成后合并提取液，抽濾，并用少量相應(yīng)濃度的乙醇洗滌濾渣。向?yàn)V液中加入適量體積的乙醇，使其體積與反應(yīng)前保持一致，4℃保存，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品12.53mg，置25mL量瓶中，加適量無(wú)水乙醇溶解，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，配制成每1mL中含無(wú)水蘆丁0.50mg的溶液。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定吸取一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和山楂總黃酮溶液，分別置于25mL容量瓶中，按“2.4.1”方法立即照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在400～600nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在500.0nm處有最大吸收峰，峰型較好，如圖1、圖2所示，故選擇500.0nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收?qǐng)D譜

圖2 山楂總黃酮的紫外吸收?qǐng)D譜

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察精密量取對(duì)照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL，分別置25mL量瓶中，各加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁的線性回歸方程為A=19.716C-0.043，r=0.9993，表明蘆丁的質(zhì)量濃度在20～120μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度考察精密吸取六份3.00mL蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.4.1”方法測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.5%，精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察精密吸取3.00mL蘆丁對(duì)照品溶液和山楂總黃酮溶液，按“2.4.1”方法每隔5min記錄一次吸光度值，記錄6次。在30min內(nèi)，兩份溶液吸光度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.5%和0.4%，結(jié)果表明，30min內(nèi)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重現(xiàn)性考察精密稱取5.0g山楂六份，按“2.1”項(xiàng)下提取山楂總黃酮，精密量取0.20mL，分別置25mL量瓶中，各加水至6mL，以下按“2.4.1”方法操作，測(cè)定吸光度。六份樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.3%，表明重現(xiàn)性良好。

2.4.5 加樣回收率考察精密量取0.1mL山楂總黃酮溶液，取六份，分別加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.4.1”方法測(cè)定吸光度，計(jì)算其加樣回收率。含總黃酮以無(wú)水蘆?。–27H30O16）計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 不同產(chǎn)地山楂總黃酮的測(cè)定精密量取0.20mL“2.1項(xiàng)”下提取所得山楂總黃酮提取液置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，以下同“2.4.1項(xiàng)”操作，在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。含總黃酮以無(wú)水蘆?。–27H30O16）計(jì)，不同產(chǎn)地（山東棗莊、安徽蕪湖、山西晉城、河南新鄉(xiāng)、河南林州、河南南陽(yáng)、河北承德、廣西桂林、遼寧遼陽(yáng)、云南昆明）的山楂總黃酮的測(cè)定結(jié)果，如表2所示。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 不同產(chǎn)地山楂總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

中國(guó)山楂資源豐富，分布廣泛，種類(lèi)繁多，如伏山楂、毛山楂、桔紅山楂、裂葉山楂等，多達(dá)18種，6個(gè)變種。山楂樹(shù)結(jié)果部位的光照條件對(duì)果實(shí)的質(zhì)量影響較大，光照好的部位，其花果多，果實(shí)質(zhì)量好。光照不好的部位結(jié)果少，質(zhì)量差[1]。東北地區(qū)平均氣溫低，氣候干燥；華北地區(qū)全年平均氣溫10～16℃，降雨量適中，為我國(guó)山楂的主要栽培區(qū)，已有許多優(yōu)良品種；華南地區(qū)年平均氣溫高，降雨豐富，且土壤多為紅壤，不宜山楂種植；西南地區(qū)分布有云南山楂，生長(zhǎng)在海拔1400～3000m的向陽(yáng)山地。

山楂的質(zhì)量與其生長(zhǎng)的周?chē)h(huán)境如光照時(shí)間、溫度、水分等有密切關(guān)系。本研究中，云南山楂中總黃酮的含量明顯高于其它產(chǎn)地，這與其自身的品種有直接關(guān)系，也與其生長(zhǎng)在海拔高、光照時(shí)間長(zhǎng)的山地有關(guān)。河南、河北、山東、安徽、山西所產(chǎn)山楂總黃酮含量在3.53%～4.12%之間，含量較為接近。廣西及遼寧所產(chǎn)山楂總黃酮含量最低，分別為3.33%和3.21%。

不同產(chǎn)地的山楂品種不同，生長(zhǎng)的周?chē)h(huán)境不同，導(dǎo)致其山楂總黃酮含量有所差異。因此，對(duì)不同產(chǎn)地的山楂總黃酮進(jìn)行研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步研究提供參考，是有必要的。更深入的對(duì)山楂的品種、生長(zhǎng)環(huán)境等因素和山楂總黃酮含量之間相互關(guān)系的研究，將是我院下一步研究的重點(diǎn)。

[1] 趙煥諄,豐寶田.中國(guó)果樹(shù)志?山楂卷[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社,1996：13-15.

[2] Basu SK, Thomas JE, Acharya SN. Prospects for growth in global nutraceutical and functional food markets：a Canadian perspective[M]. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2007：637-649.

[3] Kim SH, Kang KW, Kim KW, et al. Procyanidins in Crataegus extract evoke endothelium-dependent vasorelaxation in rat aorta[J]. Life Sciences, 2000,67(2)：121-131.

[4] Pittler MH, Schmidt K, Ernst E. Hawthorn extract for treating chronic heart failure：Meta-analysis of randomized trials[J]. The American Journal of Medicine, 2003,114(8)：665-674.

[5] Quettier DC, Voiselle G, Fruchart JC, et al. Hawthorn extracts inhibit LDL oxidation[J]. Die Pharmazie, 2003,58(8)：577-581.

[6] Chen ZY, Zhang ZS, Kwan KY, et al. Endothelium-dependent relaxation induced by hawthorn extract in rat mesenteric artery[J]. Life Sciences, 1998,63(22)：1983-1991.

[7] Fan C, Yan J, Qian Y, et al. Regulation of lipoprotein lipase expression by effect of hawthorn flavonoids on peroxisome proliferator response element pathway[J]. Journal of Pharmacological Sciences, 2006,100(1)：51-58.

[8] Shih CC, Lin CH, Lin YJ, et al. Validation of the Antidiabetic and Hypolipidemic Effects of Hawthorn by Assessment of Gluconeogenesis and Lipogenesis Related Genes and AMPActivated Protein Kinase Phosphorylation[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2013.

[9] Chang Q, Zuo Z, Harrison F, et al. Hawthorn[J]. Journal of Clinical Pharmacology, 2002,42(6)：605-612.

[10] Chang WT, Dao J, Shao ZH. Hawthorn：potential roles in cardiovascular disease[J]. Am J Chin Med, 2005, 33(1)：1-10.

[11] Dahmer S, Scott E. Health effects of hawthorn[J]. Am Fam6. Physician, 2010,81(4)：465-468.

[12] Svedstr?m U, Vuorela H, Kostiainen R, et al. Highperformance liquid chromatographic determination of oligomeric procyanidins from dimers up to the hexamer in hawthorn[J]. Journal of Chromatography A, 2002,968(1-2)：53-60.

[13] Edwardsa JE, Brown PN, Talent N, et al. A review of the chemistry of the genus Crataegus[J]. Phytochemistry, 2012,79(3)：25-26.

Analysis of Total Flavonoids inCrataegus Pinnatifida Bge. From Different Areas by UV-VIS Spectrophotometry

Ma Yanbin Zeng Jianxun Zhang Junpeng Li Ruiming Liu Yi Ling Yaorong

ObjectiveTo establish a UV-VIS spectrophotometry method to determine total flavonoids inCrataegus pinnatifida Bge.from different areas.MethodsTotal flavonoids ofCrataegus pinnatifida Bge.was extracted by ultrasonic method, and was determined by UV-VIS spectrophotometry at 500 nm.ResultsThe linearity of rutin was20～120μg/mL(r=0.9993), and the average recovery ratios was 100.1%. The RSD was 0.3%(n=6). The contents of total flavonoids ranged from 3.53% to 4.12%.ConclusionThe method was simple and accurate, and it could be used for the determination of total flavonoids quickly. The contents of total flavonoids was different from different areas.It provided some academic basis for quality standard ofCrataegus pinnatifida Bge..

Crataegus pinnatifida Bge.; Total flavonoids; UV-VIS spectrophotometry

R927.2

A

1673-5846(2013)06-0024-03

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510080

廣東省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目（2011A080300004）；廣東省中醫(yī)藥局科研項(xiàng)目（20121145）；廣州市生物產(chǎn)業(yè)示范工程發(fā)展專項(xiàng)項(xiàng)目（2012-243）

馬燕斌（1977.6-），女，本科，主管藥師，主要研究方向?yàn)橹兴幒歪t(yī)院藥學(xué)。E-mail：179621079@qq.com。

李瑞明（1974.7-），男，本科，主管藥師，主要研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑。E-mail：liruiming321@163.com。