SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在肝癌中的應(yīng)用

農(nóng)世澤，黃承樂，梁林慧，馮國鋼，王獻(xiàn)民（廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院檢驗科 533000）

血清甲胎蛋白（AFP）多年來一直作為診斷肝癌的重要參考依據(jù)，但是仍不夠理想，大量臨床數(shù)據(jù)也表明肝癌患者AFP陽性率波動在60%～70%，超過30%的肝癌患者即使到了中、晚期血清AFP也表現(xiàn)為陰性或低濃度陽性[1－5]。此外，慢性肝炎、肝硬化患者中AFP也有一定的陽性率[6]。因此單獨應(yīng)用AFP診斷肝癌可能導(dǎo)致AFP陰性的肝癌患者漏診，或者AFP低濃度陽性的肝癌患者難以和一些肝臟良性疾病相鑒別。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI－TOF－MS）技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種蛋白組學(xué)研究方法，以這一技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的蛋白質(zhì)芯片可以非特異性或特異性地結(jié)合被測樣本中的各種蛋白質(zhì)，進(jìn)而篩選疾病不同階段時期的特異性相關(guān)蛋白質(zhì)，能提高疾病的臨床診斷效率的疾病診斷?；赟ELDITOF－MS技術(shù)的巨大優(yōu)勢和AFP低濃度陽性時鑒別肝癌的局限性，設(shè)計了以下實驗。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以13.2μg/L＜AFP≤400μg/L判為AFP低濃度陽性，肝癌組共28例，男20例，女8例，平均年齡為（53.1±7.3）歲；肝病組共34例，男25例，女9例，其中慢性肝炎患者22例，慢性肝炎后肝硬化患者12例，平均（47.1±9.7）歲。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品檢測 取血清10μL，加入2倍體積U9緩沖液稀釋。將30μL上述變性后樣品加入360μL結(jié)合緩沖液（50 mM乙酸鈉，pH4.0）。將CM10蛋白芯片裝入生物芯片處理器，每孔加入100μL樣品，振蕩1h。每孔加入200μL結(jié)合緩沖液，振蕩5min，甩去液體，加入緩沖液重復(fù)操作一次，每孔加入羥乙基哌嗪乙磺酸200μL，立刻甩出。取出芯片，待干后，每孔加三氟乙酸0.5μL，自然干燥，上機(jī)測定。

1.2.2 數(shù)據(jù)采集 采用蛋白芯片生物系統(tǒng)Ⅱ－c型蛋白芯片閱讀儀讀取芯片信息。芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)置如下：激光強(qiáng)度180，檢測靈敏度8，優(yōu)化范圍為質(zhì)荷比（m/z）2 000～10 000。采用Ciphergen ProteinChip Software 3.2版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，信噪比（S/N）大于5為有效波峰。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 圖譜標(biāo)準(zhǔn)化后用Biomarker Wizard軟件計算各蛋白峰在組間差異的P值，用Biomarker Patterns Software軟件對差異蛋白峰值做線性分類分析，最后構(gòu)建診斷模型。

2 結(jié) 果

2.1 差異蛋白峰的篩選 28例AFP低濃度陽性肝癌患者和34例AFP低濃度陽性肝病患者血清的原始蛋白指紋圖譜經(jīng)同樣處理，在m/z 2 000～50 000范圍內(nèi)共檢測到39個蛋白峰，其中29個蛋白峰兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與AFP低濃度陽性肝病組相比，AFP低濃度陽性肝癌組血清中有5個蛋白峰上調(diào)，24個蛋白峰下調(diào)，見表1。

表1 29個蛋白峰在兩組蛋白指紋圖譜的Mean數(shù)據(jù)比較

2.2 診斷模型的建立與驗證診斷模型 由BPS完成，通過對原始圖譜的初步判斷，從篩選出的29個差異蛋白峰中選擇m/z為6 452的蛋白峰得到一個比較合理的決策樹模型（診斷模型）。該模型區(qū)分AFP陽性肝癌患者與AFP陽性肝病患者的準(zhǔn)確率為85.5%（53/62），靈敏度為82.1%（23/28），特異度為88.2%（30/34），陽性預(yù)測值為85.2%（23/27），陰性預(yù)測值為85.7%（30/35），陽性似然比為6.982，陰性似然比為0.202，見表2。

表2 兩組患者診斷模型的評價（n）

3 討 論

血清AFP一直被視為肝癌普查、早期診斷和療效評估的重要指標(biāo)之一，但是仍不夠理想，有30%～40%的肝癌患者血清AFP呈陰性，其原因可能有：（1）肝癌細(xì)胞有不同細(xì)胞株，有的能合成AFP，另一些只能合成清蛋白；如后者在癌灶中比例大，血清AFP可不升高。（2）在瘤體直徑小于3cm的小肝癌患者中，AFP可正?；蜉p度升高。（3）不是肝細(xì)胞癌，而是纖維板層癌或膽管細(xì)胞癌，AFP陽性極少見。因此目前迫切需要發(fā)展能用于臨床血清AFP陰性或低濃度陽性肝癌的診斷標(biāo)志物。

研究表明，血液中可能含有大量從未被發(fā)現(xiàn)的可作為疾病標(biāo)志物的多肽[7]。這是因為疾病早期及不同的發(fā)展階段在蛋白水平上就可表現(xiàn)出細(xì)微但重要的變化[8]。分析這些早期發(fā)生的蛋白質(zhì)變化，有望獲得臨床早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。SELDI－TOF－MS技術(shù)是蛋白質(zhì)學(xué)研究的一項全新技術(shù)，具有高通量、高靈敏度和重復(fù)性好等特點，克服了雙向電泳、光譜及其他質(zhì)譜等技術(shù)存在的缺點，目前已應(yīng)用于多種腫瘤早期診斷的研究。本文期望建立能通過SELDI－TOF－MS技術(shù)與血清AFP低濃度陽性結(jié)果聯(lián)合使用從而在整體上提高肝癌的臨床診斷效率的疾病診斷模型。應(yīng)用SELDI－TOF－MS技術(shù)，本文發(fā)現(xiàn)了29個具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異蛋白峰，其中在AFP低濃度陽性肝癌組血清中有5個蛋白峰上調(diào)，24個下調(diào)，對這些差異蛋白峰的研究將有助于解決血清AFP低濃度陽性肝癌患者與血清AFP低濃度陽性肝病患者不容易鑒別的問題。在后續(xù)的驗證實驗中，以m/z為6 452的蛋白峰建立的診斷模型，對血清AFP陽性肝癌患者與AFP陽性肝病患者的準(zhǔn)確率為85.5%，靈敏度為82.1%，特異度為88.2%，陽性預(yù)測值為85.2%，陰性預(yù)測值為85.7%，陽性似然比為6.982，陰性似然比為0.202。該模型能較好地區(qū)分血清AFP陽性肝癌患者與血清AFP陽性肝病患者，聯(lián)合血清AFP檢測可以有助于肝癌的診斷和鑒別診斷。

由于疾病本身的復(fù)雜性和個體差異的影響，以及實驗研究過程中的種種影響因素，經(jīng)研究得出的診斷模型，其實用價值的實現(xiàn)尚需要經(jīng)過實驗條件的進(jìn)一步優(yōu)化和規(guī)范化以及多中心大樣本的驗證研究才能得以完成。盡管目前SELDI－TOFMS蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)存在許多不足，但至今為止仍是高通量系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)多樣性的惟一技術(shù)平臺，隨著蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的不斷完善與進(jìn)步，它將使蛋白質(zhì)在肝癌發(fā)生、發(fā)展中作用的研究取得一系列重大突破，為人類的健康事業(yè)作出巨大貢獻(xiàn)。

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