2項(xiàng)對(duì)診斷兒童人巨細(xì)胞病毒活動(dòng)性感染的比較

李 麗（廣東省化州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 525100）

人類(lèi)巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染在我國(guó)相當(dāng)普遍，是最常見(jiàn)的宮內(nèi)感染病原體，可經(jīng)血液、唾液、精液、乳汁等分泌物傳播[1]。HCMV對(duì)人類(lèi)影響很大，尤其對(duì)免疫功能低下者，如孕婦、嬰幼兒、器官移植、惡性腫瘤類(lèi)患者還有放射損傷、獲得性免疫缺陷綜合征等。故對(duì)小兒CMV感染作早期診斷檢測(cè)是十分必要的。HCMV感染可導(dǎo)致先天性畸形，智力低下，發(fā)育遲緩等，嚴(yán)重可引起肝炎、肺炎等胃腸道疾病[2]。本文對(duì)91例臨床疑似CMV感染的患兒進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年4月至2011年6月在本院住院治療臨床上懷疑為CMV感染的患兒共計(jì)91例，男47例，女44例。年齡1個(gè)月至10歲，其中1歲以內(nèi)38例，占41.8%，大于1歲53例，占58.2%。

1.2 CMV pp65抗原血癥檢測(cè) 采用CMV BriteTMTurbo試劑盒檢測(cè)，由北愛(ài)爾蘭IQ公司提供。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。肝素或乙二胺四乙酸抗凝的空腹全血3～5mL，2h內(nèi)送檢。取蒸餾水1∶10稀釋A液（紅細(xì)胞裂解液），把2mL血與30mL稀釋A液混合，置4℃5min，2 500r/min離心2min，棄上清液。若裂解紅細(xì)胞不理想，再重復(fù)一次。把細(xì)胞團(tuán)懸于30mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，2 500r/min離心2min，棄上清液。PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL。每份標(biāo)本制備3張片，2張做檢測(cè)，1張做背景對(duì)照。用PBS 1∶5稀釋B液（固定液），用PBS 1∶5稀釋C液（滲透液），將2張片插入B液5min，再將所有片子放入PBS洗液3min，然后放入C液1 min，洗片。加35μL單抗（D液），37℃20min，洗片，晾干，細(xì)胞片不能干透。加入35μL FITC標(biāo)記抗體（E液），37℃20 min，洗2次后用自來(lái)水輕輕洗片，蓋片。

用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，鏡下觀察全部細(xì)胞，pp65陽(yáng)性細(xì)胞為均勻圓形/多葉核染色，綠色或黃綠色。陽(yáng)性細(xì)胞大于5個(gè)/5×104為陽(yáng)性。

1.3 CMV DNA檢測(cè) 取同期患兒尿液，采用深圳匹基公司HCMV DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒，擴(kuò)增循環(huán)條件按試劑盒的設(shè)定進(jìn)行，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為42個(gè)。檢測(cè)系統(tǒng)由伯樂(lè)公司提供，同時(shí)連接計(jì)算機(jī)，對(duì)整個(gè)PCR過(guò)程中PCR產(chǎn)物熒光值進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 血清CMV IgM檢測(cè) 取同期患者血清，采用微粒子酶免疫分析，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明操作，試劑由美國(guó)Abbott公司提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用一般χ2檢驗(yàn)比較pp65與CMV DNA、CMV IgM之間的關(guān)聯(lián)性，P＜0.05為有關(guān)聯(lián)性；用配對(duì)設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)（χm2）比較不同檢驗(yàn)方法結(jié)果的差異性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3項(xiàng)共檢測(cè)患兒91例，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，CMV DNA 陽(yáng)性率最高，為49.5%，其次為CMV pp65，為37.4%。

表1 3項(xiàng)檢測(cè)CMV感染結(jié)果

2.2 91例CMV患兒血pp65與尿CMV DNA和血CMV IgM檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，pp65抗原血癥與尿CMV DNA兩種方法陽(yáng)性分別為34例和24例，均具有較高的檢出率，兩種方法所檢測(cè)的結(jié)果有明顯相關(guān)性（χ2＝9.70），且結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χm2＝3.23，P＞0.05）。pp65與血CMV IgM檢測(cè)結(jié)果之間無(wú)明顯相關(guān)性（χ2＝0.77），兩種方法結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χm2＝12.03，P＜0.01）。pp65抗原血癥與尿CMV DNA陽(yáng)性符合率為75.6%（34/45），陰性符合率為80.7%，與IgM 陽(yáng)性符合率為29.4%（10/34），陰性符合率為70.4%（57/81）。pp65相對(duì)于PCR的敏感性為75.6%（34/45），特異性為 70.6% （24/34），與 HCMV DNA 相比，pp65抗原的符合率為85.5%，與IgM抗體檢測(cè)的符合率為70.3%。

表2 91例CMV患兒血pp65與尿CMV DNA和血CMV IgM檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

CMV感染在我國(guó)相當(dāng)普遍，大多在幼年時(shí)期發(fā)生。多數(shù)感染者無(wú)明顯癥狀，但在嬰兒期和有免疫抑制的個(gè)體可引起嚴(yán)重疾病[3]。CMV感染狀態(tài)可分為潛伏感染和激活感染，由于健康人群中CMV潛伏感染也較常見(jiàn)，因此區(qū)分潛伏感染和激活感染是臨床診斷CMV感染的關(guān)鍵。目前臨床上常用檢測(cè)CMV的項(xiàng)目有血CMVpp65、尿CMV DNA及血CMV IgM[4]。

本文結(jié)果顯示，血CMVpp65和尿CMV DNA 2項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均有較高的陽(yáng)性率，陽(yáng)性符合率也較高，且統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示結(jié)果上具有明顯相關(guān)性，結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CMV pp65是CMV－u183基因編碼的即刻早期蛋白，在CMV DNA復(fù)制前就有合成，調(diào)控隨后的病毒基因的表達(dá)及DNA合成，是體內(nèi)活動(dòng)性CMV復(fù)制的標(biāo)志。因此，CMV激活感染時(shí)，pp65持續(xù)高水平表達(dá)，潛伏感染時(shí)表達(dá)極低，一般檢測(cè)不到。而且pp65抗原血癥可在激活感染早期即呈陽(yáng)性。目前認(rèn)為pp65抗原是HCMV感染時(shí)外周血白細(xì)胞中最容易被檢出的CMV抗原，HCMV pp65抗原血癥作為免疫組化法直接檢測(cè)血液白細(xì)胞中的CMV抗原，不但具有快速、簡(jiǎn)便、容易操作的特點(diǎn)[5－7]，而且還能根據(jù)結(jié)果區(qū) 分患者 CMV 的感染狀態(tài)，在CMV活動(dòng)性感染及預(yù)后判斷上有明顯優(yōu)勢(shì)。有研究表明，可以根據(jù)CMV抗原血癥水平來(lái)推斷CMV感染的類(lèi)型和時(shí)期，原發(fā)感染抗原血癥水平高，繼發(fā)感染抗原血癥水平低；感染初期及恢復(fù)期水平低，發(fā)生進(jìn)展性CMV疾病時(shí)水平迅速上升。PCR檢測(cè)技術(shù)是近年來(lái)新興的一種技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感且檢測(cè)標(biāo)本要求低等特點(diǎn)，但是PCR要求有較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，否則極易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果；并且PCR要求有一定的設(shè)備，如PCR擴(kuò)增儀，還要求有合理的引物設(shè)計(jì)及需要購(gòu)Tap酶等，花費(fèi)較大。由于PCR的高靈敏性，存在敏感性雖高但特異性差的缺點(diǎn)，而且PCR檢測(cè)陽(yáng)性不能區(qū)分是潛伏感染還是激活感染，所以PCR的應(yīng)用受到一定的限制。

本組實(shí)驗(yàn)CMV IgM的檢出率較低。IgM的量不僅與病毒負(fù)荷有關(guān)，還與患者免疫功能狀態(tài)有關(guān)。CMV感染患兒多有免疫功能低下，也影響其敏感性和特異性。另外檢測(cè)血CMV IgM易受類(lèi)風(fēng)濕因子及特異性IgG的影響，靈敏度較低。因此，檢測(cè)CMV IgM在診斷CMV感染中的價(jià)值受到限制。

對(duì)于CMV感染，pp65抗原血癥法檢測(cè)CMV pp65抗原是一種敏感、特異、快速的診斷方法；不僅能早期診斷，其量化結(jié)果有助于評(píng)價(jià)感染狀態(tài)與判斷預(yù)后，也是觀察治療后果的有效檢測(cè)手段[8]。pp65抗原血癥法方法學(xué)幾經(jīng)完善，已成為國(guó)際公認(rèn)的活動(dòng)性HCMV感染診斷的“標(biāo)準(zhǔn)”方法，以后相繼建立的方法均以此方法作為對(duì)照。

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