AQP3對(duì)體外培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)直徑的影響

安 鵬， 張亞偉， 張德鋒， 劉明蘭， 雷安民

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌712100

AQP3對(duì)體外培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)直徑的影響

安 鵬， 張亞偉， 張德鋒， 劉明蘭， 雷安民*

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌712100

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)技術(shù)與顯微實(shí)時(shí)攝影技術(shù)相互結(jié)合，使得體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟過程的全程記錄監(jiān)控成為可能。本研究利用這一技術(shù)對(duì)牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了觀測(cè)并進(jìn)行了一些初步分析，用以監(jiān)測(cè)卵母細(xì)胞體外成熟的過程，初步探索掌握牛卵母細(xì)胞體外成熟過程的形態(tài)學(xué)變化規(guī)律，為相關(guān)領(lǐng)域的深入研究提供參考。在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)、外分別進(jìn)行牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)，在確定環(huán)境對(duì)卵成熟影響的基礎(chǔ)上，利用顯微實(shí)時(shí)攝像系統(tǒng)監(jiān)控牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化與第一極體排出率。結(jié)果表明，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)、外的不同環(huán)境下培養(yǎng)，牛卵母細(xì)胞成熟率沒有顯著差異（P＞0.05）。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)卵母細(xì)胞成熟過程，發(fā)現(xiàn)部分卵母細(xì)胞存在一個(gè)短時(shí)間的胞質(zhì)膨漲并隨之恢復(fù)原體積的過程，而且這類卵母細(xì)胞最終死亡，造成這種現(xiàn)象的原因推測(cè)是與卵子中一種叫做AQP3的水通道蛋白有關(guān)。

牛；卵母細(xì)胞；體外培養(yǎng)；形態(tài)觀察；AQP3

隨著胚胎工程逐步深入的研究，卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)逐步完善，利用體外成熟卵母細(xì)胞作為核受體的體細(xì)胞克隆在眾多的實(shí)驗(yàn)室都已經(jīng)獲得成活動(dòng)物，同時(shí)卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)也作為人類輔助生殖技術(shù)的一個(gè)基本支撐技術(shù)而在臨床治療中發(fā)揮作用。但人們對(duì)于卵母細(xì)胞的成熟調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)仍然很局限，臨床上卵母細(xì)胞的體外成熟效率與卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量仍有改善提高的空間［1］。只有通過對(duì)卵母細(xì)胞成熟進(jìn)行更為深入的研究，更加深入探索卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控因素，才能夠解決上述問題。對(duì)卵母細(xì)胞的體外成熟機(jī)制開展研究就需要對(duì)卵母細(xì)胞成熟過程中涉及的重要蛋白的功能進(jìn)行研究。目前在對(duì)特定蛋白功能進(jìn)行研究時(shí)，多利用哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)技術(shù)與顯微實(shí)時(shí)攝影技術(shù)相互結(jié)合，通過對(duì)卵母細(xì)胞成熟過程的有效記錄和監(jiān)控來分析研究靶蛋白的調(diào)控作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞的直徑和卵泡的直徑大小與卵母細(xì)胞成熟之間具有一定的關(guān)系。在一定范圍內(nèi)，卵母細(xì)胞直徑相對(duì)大一些的卵子經(jīng)歷正常的減數(shù)分裂的比率更高［2，3］。對(duì)于牛卵泡大小對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響，有報(bào)道稱，選取直徑大于4 mm的卵泡所得的卵母細(xì)胞質(zhì)量更好［4，5］。但是，對(duì)于卵母細(xì)胞在體外成熟過程中形態(tài)變化的文獻(xiàn)卻鮮見報(bào)道。

體外成熟過程通常將卵丘細(xì)胞擴(kuò)散并排出第一極體作為卵子成熟的標(biāo)志。卵母細(xì)胞的成熟分為核成熟和質(zhì)成熟。受精前卵細(xì)胞核會(huì)發(fā)生生發(fā)泡破裂、染色質(zhì)濃縮和第一極體排出幾個(gè)明顯的形態(tài)變化［5］，從而達(dá)到核成熟；質(zhì)成熟過程則是在對(duì)應(yīng)于極體排出的部位形成無微絨毛的區(qū)域，細(xì)胞質(zhì)周隙擴(kuò)大，線粒體發(fā)生重新分布［6］。卵母細(xì)胞成熟過程中細(xì)胞質(zhì)的一系列復(fù)雜的變化過程，對(duì)卵母細(xì)胞以后的受精和發(fā)育都具有重要的影響［2］。而形態(tài)學(xué)上目前并沒有對(duì)細(xì)胞質(zhì)成熟給出一個(gè)確切的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。

本研究利用卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)并結(jié)合顯微實(shí)時(shí)攝影技術(shù)對(duì)牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，為深入研究牛卵母細(xì)胞的體外成熟調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器設(shè)備包括：PCR擴(kuò)增儀、CO2培養(yǎng)箱、Leica恒溫板、保溫遮光罩、Eppendorf微量移液器、封口膜、Eppendorf顯微鏡、實(shí)時(shí)攝影系統(tǒng)、體式顯微鏡、一次性35 mm塑料皿（購(gòu)自NUNC公司）和一次性0.22μm濾器（購(gòu)自Milipore公司）。

主要試劑為：TCM-199（購(gòu)自Sigma公司）、牛血清白蛋白（BSA）（購(gòu)自Amresco）、胎牛血清（FBS）（購(gòu)自HyClone）、新生牛血清（NBS）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉（ITS）（購(gòu)自Gibco）、人尿促性素（hMG）（麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）、礦物油（Sigma公司）、注射用青霉素（購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠）、注射用硫酸鏈霉素（購(gòu)自華北制藥股份有限公司）、尿嘧啶、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、0.25%透明質(zhì)酸酶、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、雌二醇、卵母細(xì)胞裂解液、Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒、HgCl2（購(gòu)自Sigma）、Takara SYBR?Premix Ex TaqTM II等。

1.2 牛卵母細(xì)胞的采集

自西安市屠宰場(chǎng)采集性成熟牛的卵巢組織，放入無菌生理鹽水（30℃，含有雙抗），在6 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。剪去卵巢附屬組織，用無菌生理鹽水（37℃，含有雙抗）清洗3次，選擇卵巢表面直徑為2～8 mm的卵泡抽取卵泡液，放入10 mL離心管中，靜置5 min，棄去上清液，加入6～8 mL的卵母細(xì)胞洗液，輕輕吹打后靜置3～5 min，再棄去上清液，反復(fù)3次，將沉淀物轉(zhuǎn)移到60 mm的培養(yǎng)皿中，體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻，并有3層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complexes，COCs）。

1.3 CO2培養(yǎng)箱外卵母細(xì)胞的培養(yǎng)

用配制好的新鮮牛卵母細(xì)胞成熟液在35 mm塑料nuclone平皿內(nèi)做80μL液滴，并在其上覆蓋不少于2 mL的礦物油直至將液滴完全覆蓋。在CO2培養(yǎng)箱中平衡細(xì)胞成熟培養(yǎng)液2 h，清洗挑選的COCs 3遍，隨機(jī)分配到液滴內(nèi)，每個(gè)液滴收集卵母細(xì)胞數(shù)不超過30枚，將平皿用封口膜封口，放于提前預(yù)熱至38.5℃的恒溫板上，放置一皿潔凈的水以保持相對(duì)濕度，同時(shí)覆蓋保溫避光罩，穩(wěn)定培養(yǎng)21～22 h后，用口吸管將COCs移入含0.25%透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)液內(nèi)，在38.5℃環(huán)境下作用5 min之后，將1 000μL微量移液器調(diào)至量程為200μL反復(fù)吹打有卵母細(xì)胞的培養(yǎng)液，然后將卵母細(xì)胞移入牛卵母細(xì)胞操作液中，將卵丘細(xì)胞仍未剝離干凈的卵母細(xì)胞繼續(xù)吹打，在牛卵母細(xì)胞操作液里清洗3次完全除去卵母細(xì)胞外圍的卵丘細(xì)胞。在體視顯微鏡下觀察裸卵第一極體（PBI）的排出情況，統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)并計(jì)算成熟率。試驗(yàn)過程中設(shè)置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)變化觀察

用平衡后的成熟液清洗COCs3遍后，隨機(jī)分配到含有成熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，在38.5℃、5%（V／V）CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 h。用配制好的新鮮牛卵母細(xì)胞成熟液在35 mm塑料培養(yǎng)皿中做液滴，每個(gè)液滴10μL，并用礦物油完全覆蓋液滴，在CO2培養(yǎng)箱中提前平衡2 h。將COCs移入牛卵母細(xì)胞操作液中，清洗3次，再移入含0.25%透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)液內(nèi)，38.5℃放置5 min后反復(fù)吹打，去除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞層，再清洗3次以完全除去卵丘細(xì)胞。挑選顆粒細(xì)胞被剝離干凈而且狀態(tài)良好的裸卵，移入平衡后的操作液中恢復(fù)30 min，然后用成熟液清洗3次，將卵母細(xì)胞移入已準(zhǔn)備好的10μL液滴中，每個(gè)液滴中放的卵母細(xì)胞的數(shù)目不超過20枚。轉(zhuǎn)移過程中力求將卵母細(xì)胞集中在液滴中心位置，將此培養(yǎng)皿用封口膜封口。在Eppendorf顯微鏡下觀察，并結(jié)合實(shí)時(shí)攝影系統(tǒng)對(duì)成熟培養(yǎng)11 h的卵母細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)實(shí)時(shí)拍攝觀察，拍攝時(shí)間間隔為4min／幀，連續(xù)拍攝12 h，拍攝過程中顯微鏡觀察倍數(shù)為200倍視野，觀察卵母細(xì)胞在此過程中的形態(tài)變化。

1.5 卵母細(xì)胞中AQP3基因的表達(dá)

分別收集實(shí)驗(yàn)中胞質(zhì)膨大與未膨大的卵母細(xì)胞以及培養(yǎng)箱中對(duì)照組的卵母細(xì)胞，用臺(tái)式酸去除透明帶，各取20枚去除透明帶的卵子用5μL卵母細(xì)胞裂解液裂解，放于-80℃低溫冰箱中反復(fù)凍融，以求充分裂解，以此為模板進(jìn)行RT-PCR以獲取cDNA，通過半定量PCR檢測(cè)卵母細(xì)胞中AQP3基因的表達(dá)。

1.6 卵母細(xì)胞胞質(zhì)膨大的原因

用平衡后的成熟培養(yǎng)液清洗COCs3次，隨機(jī)分配到含有成熟培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中，在38.5℃、5%（V／V）CO2和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10 h后，隨機(jī)選取部分COCs將其脫去卵丘細(xì)胞，隨后將其分別置于以下4種不同的環(huán)境下培養(yǎng)：①低滲環(huán)境中，將已經(jīng)配制好的成熟液中加入適量的水以配制成低滲成熟液，在35 mm平皿內(nèi)用20μL低滲成熟液做液滴，表面覆蓋礦物油，取20枚卵母細(xì)胞置于其中；②低滲成熟液＋HgCl2，在配制好的低滲成熟液中添加HgCl2（50μmol／L）以此做20μL的液滴并同樣覆蓋礦物油，同樣取20枚卵母細(xì)胞置于此液滴中；（正常成熟液中添加HgCl2（50μmol／L）依上法同樣做20μL液滴并將20枚卵母細(xì)胞置于其中；（將同樣數(shù)量的卵母細(xì)胞置于用正常成熟液做成的液滴中。將這4種條件下的卵母細(xì)胞置于Eppendorf顯微鏡200倍視野下觀察，并結(jié)合實(shí)時(shí)攝影系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，拍攝時(shí)間間隔為4 min／幀，連續(xù)拍攝12 h，同時(shí)在培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)一組同樣數(shù)量的卵母細(xì)胞，作為陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2培養(yǎng)箱外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟率的統(tǒng)計(jì)

在CO2培養(yǎng)箱外培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞并統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率，以在培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)的牛卵母細(xì)胞為對(duì)照組。結(jié)果表明，牛卵母細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱外培養(yǎng)，保證卵母細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境在38.5℃溫度恒定，并保證培養(yǎng)環(huán)境的飽和濕度，其成熟率與在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)部正常培養(yǎng)的卵母細(xì)胞成熟率沒有顯著差異（P＞0.05）（表1）。

表1 不同培養(yǎng)條件下對(duì)卵母細(xì)胞成熟的影響Table 1 The effect of different culture conditions on oocytesmaturation.

2.2 牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)變化觀察

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)活動(dòng)劇烈，可以明顯看到胞質(zhì)內(nèi)成分的運(yùn)動(dòng)，隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行，在體外成熟培養(yǎng)18～20 h時(shí)，部分卵母細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)膨大的現(xiàn)象（圖1），胞質(zhì)直徑由119μm上升到121.5μm（表2），持續(xù)時(shí)間不少于10 min，而且具體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短視不同的卵母細(xì)胞有差異；隨后又會(huì)有一個(gè)恢復(fù)到原來狀態(tài)的過程。但是隨后觀察發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)內(nèi)運(yùn)動(dòng)劇烈的卵母細(xì)胞在發(fā)生膨大前劇烈運(yùn)動(dòng)停止，表明卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，且最終都死亡。

圖1 牛卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)變化（200×）Fig.1 Morphological changes of bovine oocytes cultured in vitro（200×）.

圖2 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的直徑變化Fig.2 Oocytes cultured in vitro in the process of change in diameter.

2.3 AQP3基因在牛卵母細(xì)胞中的表達(dá)

水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是一種普遍存在于多種類型細(xì)胞內(nèi)的膜通道蛋白（25～34 kDa）有多種亞型［7］。目前已克隆的哺乳動(dòng)物水通道蛋白家族有13個(gè)成員（AQP0～AQP12）［8，9］，而且其中11個(gè)成員（AQP0～AQP10）已經(jīng)在雄性和雌性生殖分泌系統(tǒng)中得到鑒定［10］。AQP3作為水通道蛋白家族中的一員，已經(jīng)在小鼠卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)AQP3在小鼠卵母細(xì)胞的質(zhì)量控制以及體外受精率等方面發(fā)揮重要作用。取胞質(zhì)膨大與未膨大及對(duì)照組的卵母細(xì)胞，裂解后分別經(jīng)過半定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，胞質(zhì)膨大組以及對(duì)照組檢測(cè)到AQP3基因的存在，而胞質(zhì)未膨大組卻沒有AQP3基因。由此，我們認(rèn)為牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)是否發(fā)生膨大現(xiàn)象與水通道蛋白AQP3的表達(dá)與否有重要聯(lián)系。

圖3 PCR檢測(cè)AQP3基因在牛卵母細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of AQP3 gene in bovine oocytes by PCR.

2.4 牛卵母細(xì)胞胞質(zhì)膨大的原因及與AQP3基因的關(guān)系

卵母細(xì)胞在低滲成熟液中培養(yǎng)出現(xiàn)胞質(zhì)膨大的比例高達(dá)88.83%，這與正常成熟液中的出現(xiàn)的7.30%的比例相比差異極顯著。而在含有HgCl2的低滲成熟液中培養(yǎng)，出現(xiàn)胞質(zhì)膨大現(xiàn)象的卵母細(xì)胞也僅占到8.63%，這與低滲成熟液條件下培養(yǎng)的超過八成的比例有很明顯的降低，同時(shí)其與正常成熟液培養(yǎng)條件下出現(xiàn)胞質(zhì)膨大比例的差異不顯著（圖4）。由此推測(cè)，卵母細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)膨大現(xiàn)象的直接原因就是低滲環(huán)境使細(xì)胞外部的水等非電解質(zhì)通過AQP3通道蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部造成的。

圖4 不同培養(yǎng)條件下卵母細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)生膨大的情況Fig.4 The oocyte cytoplasm occurs swollen under different culture conditions.

3 討論

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)是哺乳動(dòng)物生殖研究中必要的一種技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但是卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)仍然只局限于實(shí)驗(yàn)室中操作，對(duì)于所需儀器設(shè)備要求嚴(yán)格，所需環(huán)境比較苛刻，一些基層科研單位和普通生產(chǎn)單位并不能得以滿足，不利于基層單位開展與之相關(guān)的研究與應(yīng)用工作，而且攜帶不方便。在此之前本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)利用密閉氣袋的方式體外培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞，并得出應(yīng)用簡(jiǎn)易密閉氣袋進(jìn)行體外卵母細(xì)胞培養(yǎng)，能夠發(fā)育到囊胚并且其體外成熟率、卵裂率和囊賠率與正常CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相比略有升高的結(jié)論［11］。本文中采用的技術(shù)不用整個(gè)過程都需要CO2培養(yǎng)箱，僅需要礦物油和恒溫?zé)岚寮纯桑谝粯O體的排除率相對(duì)于正常培養(yǎng)箱組的卵母細(xì)胞沒有明顯的差異。而且本技術(shù)的應(yīng)用，使在顯微鏡下對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的形態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察更加便利。

目前為止，牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相對(duì)成熟。但是卵母細(xì)胞在第一次減數(shù)分裂過程其形態(tài)變化的觀察卻鮮見報(bào)道。卵母細(xì)胞的成熟是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的過程，有許多代謝事件發(fā)生，除了進(jìn)行積極的mRNAs轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成外，還有其他一些物質(zhì)的降解［12］。眾所周知，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育過程中會(huì)發(fā)生兩次或三次停滯，第一次停滯發(fā)生在第一次減數(shù)分裂前期的雙線期，即生發(fā)泡期［13］。當(dāng)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂時(shí)，發(fā)生生發(fā)泡破裂（GVBD），繼而染色體發(fā)生凝集，形成MI期紡錘體，之后進(jìn)入AI／TI期，排出第一極體（PBI），同時(shí)發(fā)育停滯在MII期，當(dāng)受精或者孤雌激活之后，卵母細(xì)胞恢復(fù)并完成第二次減數(shù)分裂排出第二極體（PBII）。

本研究中，我們借助實(shí)時(shí)攝影技術(shù)觀察牛的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中形態(tài)的變化，卵母細(xì)胞在發(fā)生膨大前卵胞質(zhì)的劇烈運(yùn)動(dòng)停止，隨后出現(xiàn)明顯的逐漸脹大隨后又恢復(fù)到原來的大小，最后趨于死亡的現(xiàn)象。經(jīng)過多次實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同批次的卵母細(xì)胞發(fā)生胞質(zhì)膨大的概率不同，我們認(rèn)為這可能與卵母細(xì)胞的批次不同有關(guān)，也可能與卵母細(xì)胞的個(gè)體差異有關(guān)。造成這種膨大現(xiàn)象的原因我們認(rèn)為可能與一種被稱為AQP3的水通道蛋白有關(guān)，進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其直接原因應(yīng)該是培養(yǎng)液的低滲環(huán)境，使培養(yǎng)液中的水分等非電解質(zhì)通過AQPs通道蛋白順利進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而使卵母細(xì)胞體積瞬間膨大，從而影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

迄今為止，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)至少有13種水通道蛋白（AQP0～AQP12）。在所有已知的AQP中，AQP3為水-甘油亞家族，除對(duì)水有高的通透性外，對(duì)尿素和甘油也有較高的通透性［14］。發(fā)生胞質(zhì)膨大的卵母細(xì)胞可能與AQP3蛋白表達(dá)有一定關(guān)系。本研究中，我們分別將發(fā)生膨大組與未發(fā)生膨大組的卵母細(xì)胞分別取樣，通過PCR檢測(cè)牛卵母細(xì)胞中AQP3基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組卵母細(xì)胞以及發(fā)生膨大的卵母細(xì)胞中均存在AQP3的表達(dá)，而未發(fā)生胞質(zhì)膨大的卵母細(xì)胞中卻沒有檢測(cè)到AQP3。隨后我們分別通過向等滲和低滲成熟培養(yǎng)液中添加或不添加AQPs的特異性抑制劑HgCl2，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)4組卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中的變化情況，發(fā)現(xiàn)低滲培養(yǎng)液中未添加HgCl2組的卵母細(xì)胞大部分發(fā)生膨大現(xiàn)象并最終趨于死亡。這與我們預(yù)期的結(jié)果是一致的。Edashige等［15］首次在小鼠MII期卵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了AQP3和AQP7的表達(dá)。隨后發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)AQP3的表達(dá)會(huì)提高對(duì)水和甘油的通透性，對(duì)于維持卵子的受精能力有一定作用。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低滲培養(yǎng)液造成的卵母細(xì)胞的膨大由于HgCl2的參與而受到抑制，Hg2＋作為AQPs的特異性抑制劑，特異的抑制卵母細(xì)胞水通道蛋白的作用，從而可以抑制低滲溶液中水分等進(jìn)入卵母細(xì)胞，由此可見AQP3在卵母細(xì)胞的水分轉(zhuǎn)運(yùn)方面起著很重要的作用。這與之前的報(bào)道結(jié)果相符［16］。

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Effects of AQP3 on Bovine Oocytes Cytoplasm Diameter During IVM

AN Peng，ZHANG Ya-wei，ZHANG De-feng，LIU Ming-lan，LEIAn-min*
Shaanxi Center of Stem Cell Engineering＆ Technology，College of Veterinary Medicine，Northwest A＆ F University，Shaanxi Yangling 712100，China

Combination of the IVM of mammalian oocytes and microstructure of real-time photographic technique makes the monitoring of the entire process of oocyte IVM possible.We observed morphological changes of bovine oocytes cultured in vitro using this technology and made preliminary analysis.The purpose of this study ismonitoring oocytematuration process in vitro，exploring and mastering the morphological variation pattern of bovine oocytes maturation process in vitro，so as to provide a reference for in-depth study of related fields.Bovine oocytes matured in vitro inside and outside CO2incubator，respectively.Base on confirming the impactofenvironmenton the oocytesmaturation，microscopic real-time camera system was used tomonitor morphological changes of bovine oocytesmaturation process in vitro and the rate of the first polar body emission in the process.The results showed thatbovine oocytematuration rate indicated no significant differences（P＞0.05）under differentenvironments such as inside or outside the CO2incubator.Through real-timemonitoring oocytematuration process，we found that partof oocyte cytoplasm would swelland restore subsequently in a short period of time，and then died eventually.The cause of this phenomenon was presumably associated with a called AQP3 water channel protein in oocytes.

bovine；oocytes；IVM；morphological observation；AQP3

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.07

2012-12-30；接受日期：2013-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31172280）資助。

安鵬，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物胚胎工程。E-mail：ap-315＠163.com。*通訊作者：雷安民，主要從事卵母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控以及核移植。Tel：029-87080068；E-mail：anminleiryan＠nwsuaf.edu.cn