Caco－2細胞中8－羥基二氫小檗堿和小檗堿對多藥耐藥基因表達的研究

熊茂來向紹蓉.湖北民族學院醫(yī)學院，湖北 恩施 445000；.湖北民族學院附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000

【摘 要】 目的：研究8－羥基二氫小檗堿和小檗堿與多藥耐藥基因之間的作用。方法：采用MTT比色法測定藥物的細胞毒濃度，適時定量PCR測定不同多藥耐藥基因的表達。結果：在1～100μM濃度范圍內(nèi)，8－羥基二氫小檗堿和小檗堿對Caco－2細胞無毒性作用；8－羥基二氫小檗堿和小檗堿對mdr 1和m rp 1的表達作用一致，在25～100μM范圍內(nèi)，小檗堿能明顯降低mrp 2的mRNA表達，而8－羥基二氫小檗堿對其無明顯影響。結論：8－羥基二氫小檗堿與小檗堿對mrp 2的基因表達差異較大，其對MRP 2蛋白表達的作用以及與基因調(diào)控之間的作用關系還有待更進一步的研究。

【關鍵詞】8－羥基二氫小檗堿；小檗堿；Caco－2細胞；多藥耐藥基因

【中圖分類號】R965【文獻標志碼】A【文章編號】1007－8517（2013）23－0008－03

Caco－2細胞中8－羥基二氫小檗堿和小檗堿對多藥耐藥基因表達的研究

熊茂來1向紹蓉21.湖北民族學院醫(yī)學院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院附屬民大醫(yī)院，湖北 恩施 445000

【摘 要】 目的：研究8－羥基二氫小檗堿和小檗堿與多藥耐藥基因之間的作用。方法：采用MTT比色法測定藥物的細胞毒濃度，適時定量PCR測定不同多藥耐藥基因的表達。結果：在1～100μM濃度范圍內(nèi)，8－羥基二氫小檗堿和小檗堿對Caco－2細胞無毒性作用；8－羥基二氫小檗堿和小檗堿對mdr 1和m rp 1的表達作用一致，在25～100μM范圍內(nèi)，小檗堿能明顯降低mrp 2的mRNA表達，而8－羥基二氫小檗堿對其無明顯影響。結論：8－羥基二氫小檗堿與小檗堿對mrp 2的基因表達差異較大，其對MRP 2蛋白表達的作用以及與基因調(diào)控之間的作用關系還有待更進一步的研究。

【關鍵詞】8－羥基二氫小檗堿；小檗堿；Caco－2細胞；多藥耐藥基因

【中圖分類號】R965【文獻標志碼】A【文章編號】1007－8517（2013）23－0008－03

小檗堿（Berberine）存在于許多植物如黃連等的根和根皮中，具有顯著的抗菌活性。近年發(fā)現(xiàn)還有抗心律失常、降血脂等廣泛的藥理作用，尤其是其在糖尿病治療中的應用有大量臨床報道［1］。但小檗堿很難從消化道吸收，其吸收困難的原因為小檗堿是腸上皮細胞的P－糖蛋白作用底物。8－羥基二氫小檗堿是小檗堿的衍生物其中一種［2］，藥理實驗發(fā)現(xiàn)，8－羥基二氫小檗堿與小檗堿在藥理效應同等的情況下，其應用濃度較低，因此推測8－羥基二氫小檗堿的吸收好于小檗堿。因此，本文旨在研究8－羥基二氫小檗堿和小檗堿在與多藥耐藥基因之間的作用，探討兩者之間差異的可能原因。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化工程公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；DM IRM型倒置顯微鏡（Leica，德國）；熒光分析儀（Hitachi，日本）；5810R型高速冷凍離心機（Eppendorf，德國）；7300型適時定量PCR儀（AB Inc.，美國）；酶標儀（Bio－Rad，美國）。

1.2 試藥 鹽酸小檗堿（含量97.9%，中國藥品生物制品檢定所）；8－羥基二氫小檗堿（含量95.1%，華中科技大學同濟醫(yī)學院陸付耳教授贈與）；胎牛血清（Hyclone，美國）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國）；二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽（MTT）；BCA蛋白分析試劑盒（Pierce，美國）；tRNA提取試劑（RNA STAT 60，TEL－TEST Inc.，美國）。

2 方法與結果

2.1 Caco－2細胞培養(yǎng) Caco－2細胞培養(yǎng)基采用10g／L的DMEM高糖溶液，加入10%胎牛血清，添加青霉素（10萬單位／L）、1%的非必需氨基酸和0.1 g／L的鏈霉素，培養(yǎng)條件為恒溫37℃和5%CO2，消化液為0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液。

調(diào)整Caco－2細胞密度為（1～2）×104個／ml，接種200L于96孔上，貼壁后，加入含藥物的培養(yǎng)液，用于細胞毒性實驗；調(diào)整Caco－2細胞密度為1×105個／m l，接種1m l于60mm培養(yǎng)皿上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)約7天形成單分子層膜后，用于RTPCR實驗。

2.2 Caco－2細胞的毒性實驗 采用MTT法檢測小檗堿和8－羥基二氫小檗堿對Caco－2細胞的毒性作用。96孔板接種細胞后24h，加入含藥物的培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24h后，加入5mg／ml的MTT溶液20Ll，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清液，再加入DMSO溶劑200μI，放置于水平振蕩器上振蕩約10min，置酶標儀中490nm處測定OD值。結果見圖1。經(jīng)雙側(cè)t檢驗和統(tǒng)計學方差分析表明，在1～100μM濃度范圍內(nèi)，小檗堿和8－羥基二氫小檗堿對Caco－2細胞無毒性作用；在150μM濃度和200μM濃度時，小檗堿和8－羥基二氫小檗堿對Caco－2細胞活力有顯著毒性影響（P＜0.01）。

圖1 不同濃度8－羥基二氫小檗堿和小檗堿溶液對Caco－2細胞的毒性影響（χ±s，n＝8）

2.3 適時定量PCR實驗 60mm培養(yǎng)皿中接種Caco－2細胞后，培養(yǎng)5天至融合，加入8－羥基二氫小檗堿或小檗堿溶液（5～100μM）孵育24 h后，收集細胞，提取總RNA，并合成cDNA。設計的mdr 1，mrp 1和mrp 2引物見表1。36B4作為內(nèi)參，每個反應體系總體系為14μL，包括2.33 pmol引物，4 ng cDNA，7μL SYBR Green PCR反應液。RT－PCR實驗條件如下：50℃2min，95℃10 min，95℃15 s和60℃1min循環(huán)40次。計算方式如下［3］：mRNA量＝2（CT－CT36B4），CT表示儀器測定某種基因的擴增次數(shù)，CT36B4表示儀器測定內(nèi)參36B4的擴增次數(shù)，以空白組數(shù)值為1。結果見圖2。在實驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度升高，小檗堿和8－羥基二氫小檗堿對mdr 1的表達略有降低的趨勢，但與空白組相比無明顯差異；小檗堿和8－羥基二氫小檗堿對m rp 1的表達無明顯影響；8－羥基二氫小檗堿對m rp 2的表達無明顯影響，但在25～100μM范圍內(nèi)，小檗堿能明顯降低mrp 2的mRNA表達。

表1 適時定量PCR的引物.

圖2 8－羥基二氫小檗堿和小檗堿對mdr 1（A），mrp 1（B）和m rp 2（C）mRNA表達的影響（χ±s，n＝3）

3 討論

采用Caco－2細胞進行藥物吸收機制的研究，是一種很好的模擬腸管真實生存環(huán)境的體外方法，藥物透過Caco－2細胞層的體外過程與藥物口服在腸中的吸收有良好的相關性，在此基礎上該模型還可用來研究載體如多藥耐藥蛋白與藥物轉(zhuǎn)運的關系，此方法便捷，重現(xiàn)性好，使我們在細胞水平上認識藥物在腸中的吸收達到了一個新水平。

小檗堿作為一種天然植物生物堿成分，其理化性質(zhì)、體內(nèi)、外的吸收已有一些文獻報道［4－6］。研究表明，小檗堿很難經(jīng)消化道被人體吸收，僅有約5%的小檗堿從消化道吸收，而且吸收過程個體差異很大。此外，認為腸上皮細胞的P－糖蛋白參與小檗堿的向腸腔內(nèi)外排，從而減少其吸收。8－羥基二氫小檗堿是根據(jù)小檗堿的前藥原理合成的，在小檗堿的C8位加入羥基，使其C環(huán)發(fā)生一系列變化，季胺N變成叔胺N。該衍生物是一分子狀態(tài)，易與細胞膜嵌合，從而較易通過細胞膜而被人體吸收，到達體液循環(huán)系統(tǒng)后在體內(nèi)酶的作用下，轉(zhuǎn)化成小檗堿，保留了其功能團部位，而發(fā)揮藥理活性。

研究結果表明，在對多藥耐藥基因表達的影響方面，與小檗堿降低mrp 2表達相比，8－羥基二氫小檗堿對其表達無影響，而在對mdr 1和m rp 1的表達，兩者作用趨勢相同。據(jù)已有報道表明，小檗堿吸收少與P－糖蛋白介導的藥物外排泵相關，加入P－糖蛋白抑制劑能增加小檗堿的腸道吸收，而本文實驗結果為小檗堿不但沒有增加反而有降低多藥耐藥相關蛋白MRP 2基因的表達，而且8－羥基二氫小檗堿與小檗堿對mrp 2的表達差異較大，因此其對MRP 2蛋白表達的作用以及與基因調(diào)控之間的作用關系還有待更進一步的研究。

［1］P.J.Gibbs，Seddon K.R..Berberine［J］.Alternative Medicine Review，2000，5（2）：175－177.

［2］徐麗君，陸付耳，魏世超，等.8－羥基二氫小檗堿與鹽酸小檗堿治療大鼠2型糖尿病的對比研究［J］.中西醫(yī)結合研究，2009，1（4）：173－176.

［3］G.Liang，J.Yang，J.D.Horton，et al..Diminished hepatic response to fasting／refeeding and liver X receptor agonists in mice with selective deficiency of sterol regulatory element－binding protein－1c［J］.J.Biol.Chem.，2002，277（10）：9520－9528.

［4］Nobukazu Shitan，Miyako Tanaka，Koichiro Terai，et al.Human MDR1 and MRP1 recognize berberine as their transport substrate［J］.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2007，71（1）：242－245.

［5］潘國宇，王廣基，孫建國，等.小檗堿對葡萄糖吸收的抑制作用［J］.藥學學報，2003，38（12）：911－914.

［6］Guoyu Pan，GuangjiWang，Xiaodong Liu，et al.The Involvement of PGlycoprotein in Berberine Absorption［J］.Pharmacol.Toxicol，2002，91（1）：193－197.

Study of 8－Hydroxydihydroberberine and Berberine on multidrug resistance gene in Caco－2 cellmodel

XIONGMao－lai1XIANG Shao－rong2
1.Themedical college of Hubei university for nationalities，Enshi445000，China；
2.Affiliated mingda hospital of Hubei University for nationalities，Enshi445000，China

Objective To investigate the effect of8－h(huán)ydroxydihydroberberine and berberine onmultidrug resistance gene using Caco－2 cellmodel.M ethod The damage of8－h(huán)ydroxydihydroberberine and berberine to Caco－2 cellwas evaluated by the MTTmethod.Expression ofmultidrug resistance gene includingmdr 1，mrp 1 and mrp 2 was determined by quantitative real time PCR.Result 8－h(huán)ydroxydihydroberberine and berberine had no damage to the growth of the Caco－2 cells in the concentrations of1～100μM.8－Hydroxydihydroberberine and berberine had the same effects on the expression of mdr 1 and mrp 1 gene.Berberine significantly decreased the expression ofmrp 2 gene in the concentration of 25～100μM，but there was no effect in 8－h(huán)ydroxydihydroberberinetreated groups.Conclusion The difference on the expression ofmrp 2 of 8－h(huán)ydroxydihydroberberi－ne and berberinemay imply to further study the effects on the proteins and the relationship of them.

8－h(huán)ydroxydihydroberberine；berberine；Caco－2 cell；multidrug resistance gene

2013.09.27）