有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)中年Ⅱ型糖尿病雌性大鼠的影響

高敬賢王青春查干阿爾斯楞白長(zhǎng)喜

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193

有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)中年Ⅱ型糖尿病雌性大鼠的影響

高敬賢1王青春2查干阿爾斯楞1白長(zhǎng)喜1

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193

目的：觀察游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)不同階段Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白表達(dá)的影響，為Ⅱ型糖尿病的治療提供理論依據(jù)。方法：雌性SD大鼠隨機(jī)分為3組，第9周初對(duì)糖尿病治療組進(jìn)行小劑量STZ注射，引發(fā)Ⅱ型糖尿病，并開(kāi)始對(duì)糖尿病治療運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行為期8周的游泳運(yùn)動(dòng)。在第16周末取材對(duì)骨骼肌瘦素受體蛋白含量、胰島素、血糖、體重等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：糖尿病治療對(duì)照組骨骼肌瘦素受體蛋白含量下降（P＜0.05），空腹胰島素、血糖均升高（P＜0.01）；游泳運(yùn)動(dòng)后，治療糖尿病運(yùn)動(dòng)組骨骼肌瘦素受體蛋白含量升高（P＜0.05）；空腹胰島素和血糖均下降（P＜0.05）。結(jié)論：小劑量STZ和高脂膳食共同作用可成功誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗伴有瘦素抵抗；有氧運(yùn)動(dòng)使大鼠體內(nèi)骨骼肌瘦素受體蛋白含量增加，瘦素敏感性升高，改善Ⅱ型糖尿病的胰島素抵抗和瘦素抵抗，對(duì)Ⅱ型糖尿病起到一定的治療作用。

有氧運(yùn)動(dòng)；Ⅱ型糖尿??；胰島素；血糖；骨骼肌瘦素受體

Ⅱ型糖尿病占糖尿病總數(shù)的90%，發(fā)病基礎(chǔ)除胰島素抵抗之外，肥胖也是Ⅱ型糖尿病的又一危險(xiǎn)因素［1］。瘦素是由肥胖基因編碼、脂肪組織分泌的蛋白類激素，在Ⅱ型糖尿病的發(fā)展過(guò)程中，瘦素分泌比正常水平要高，而瘦素可通過(guò)外周途徑紊亂機(jī)體對(duì)糖、脂肪代謝。機(jī)體骨骼肌、肝臟、脂肪組織是瘦素和胰島素作用的重要靶器官，瘦素受體表達(dá)減弱可使瘦素不能與瘦素受體結(jié)合發(fā)揮正常的生理作用，對(duì)外周組織的代謝調(diào)節(jié)作用受損，是造成胰島素抵抗的又一因素［2－4］。

瘦素及其骨骼肌上的受體與Ⅱ型糖尿病的關(guān)系仍在探索之中，它們?cè)冖蛐吞悄虿〉陌l(fā)生發(fā)展中起到什么樣的作用，能否用運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌等外周組織瘦素受體蛋白的表達(dá)，改善瘦素抵抗，升高機(jī)體對(duì)瘦素敏感性，從而改善Ⅱ型糖尿病機(jī)體內(nèi)發(fā)生的胰島素抵抗現(xiàn)象，具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值，也具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 10月齡雌性SD大鼠，由沈陽(yáng)雙義實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供。

1.2 方法步驟

1.2.1 Ⅱ型糖尿病模型的建立 42只10月齡雌性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分3組：正常對(duì)照組、糖尿病治療對(duì)照組、糖尿病治療運(yùn)動(dòng)組并分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。正常對(duì)照組喂基礎(chǔ)飼料，其余2組高脂飼料喂養(yǎng)。每天記錄大鼠的攝食量，每周定時(shí)測(cè)體重。8周后，以35mg／kg的劑量對(duì)糖尿病治療組大鼠腹腔內(nèi)一次性注射鏈脲佐菌素（STZ），在72小時(shí)后尾靜脈進(jìn)行取血，測(cè)血糖，當(dāng)血糖值≥16.7mmol／L時(shí)表明Ⅱ型糖尿病大鼠造模成功，如果血糖值＜16.7mmol／L則繼續(xù)注射鏈脲佐菌素，直至≥16.7mmol／LⅡ型糖尿病模型確立為止。

1.2.2 游泳運(yùn)動(dòng) 給運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行8周自由游泳運(yùn)動(dòng)。泳池水深度為50cm，每只動(dòng)物約占有350mm2的活動(dòng)表面積。水溫32～36℃。前2天試游10min，逐漸加量，前2周每天游40min，第7、8周按10min／40g體重定游泳時(shí)間，每周6天。

1.2.3 收集標(biāo)本 大鼠結(jié)束運(yùn)動(dòng)24h后，禁食12h，腹腔內(nèi)以（1.5g／kg）注射氨基甲酸乙酯麻醉，尾部取血制血清（測(cè)血清胰島素、血糖用）。收集血清：3500rpm離心10min，分離血清。后腹腔內(nèi)注射胰島素（3.3U／kg），尾部取血測(cè)血糖。分離腓腸?。ㄒ詼y(cè)定骨骼肌瘦素受體蛋白含量）。密封于－80℃冰箱保存，待測(cè)。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1 空腹血糖的測(cè)定：使用血糖儀測(cè)定。

1.2.4.2 血清胰島素的測(cè)定：用放射免疫法。操作步驟：試劑充分溶解，平衡至室溫后，按表1順序加樣并操作。結(jié)果由自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

表1 胰島素放免分析操作程序表（ul）

1.2.4.3 測(cè)骨骼肌瘦素受體蛋白 （1）蛋白提取：取液氮中凍存的標(biāo)本，剪碎組織塊，加冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液200μL，冰水浴中超聲粉碎。4℃，12000rpm離心1h，取上清。

（2）測(cè)定蛋白濃度：參考試劑盒說(shuō)明，用考馬斯亮藍(lán)法。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為0.56mg／mL，加考馬斯亮藍(lán)G250后室溫靜置10min，于595nm處測(cè)各管吸光度。根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果，用裂解緩沖液調(diào)整各標(biāo)本至相同的蛋白濃度。

蛋白含量（mg／ml）＝OD標(biāo)本／OD標(biāo)準(zhǔn)品×標(biāo)準(zhǔn)濃度

（3）蛋白的變性：取標(biāo)本蛋白100μL，加100μL樣品緩沖液，煮沸5分鐘。

（4）配膠：①10%分離膠10ml：Acr 3.2mL，Tris／HCL緩沖液（PH8.8）2.5mL，蒸餾水4mL，APS 50μL，SDS 100μL，TEMED 20μL。②4%濃縮膠10mL：Acr 1.4mL，Tris／HCL緩沖液（PH6.8）2.5mL，蒸餾水6mL，APS 0.1mL，SDS 0.1mL，TEMED 20μL。灌注分離膠后，加少量去離子水，室溫下充分聚合后，傾去去離子水，用濾紙吸干，灌注濃縮膠，聚合后，拔出梳子。各標(biāo)本蛋白上樣50μL。

（5）電泳：上清用12%SDS－PAGE分離，BIO－RAD電泳板，雙板條件為150V，30mA，2小時(shí)。

（6）轉(zhuǎn)印、封閉：硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)印液中平衡10分鐘，然后膠在負(fù)極，膜在正極的原則，經(jīng)2小時(shí)50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜1次。用含5%去脂奶粉TTBS封閉4℃過(guò)夜。

（7）：孵育：取出膜后，TBS洗膜5分鐘×3次，加一抗（1：400），室溫下2h。加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1：2000），室溫下2h。

（8）清洗顯色：TTBS洗5分鐘×2次，TBS洗5分鐘×1次。然后用酶顯法顯色。

（9）Western Blot結(jié)果量化分析：采用FlourChem V2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條蛋白電泳帶灰度值，進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，所有數(shù)據(jù)用±s來(lái)表示，用t檢驗(yàn)兩組間比較，用方差分析對(duì)多組進(jìn)行比較用。

2 結(jié)果

2.1 高脂飼料喂養(yǎng)后各組大鼠體重的變化 由表2可知，經(jīng)八周高脂飼料飼養(yǎng)養(yǎng)后，糖尿病治療模型組體重顯著高于基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)養(yǎng)的正常對(duì)照組（P＜0.01）。糖尿病治療模型組體重均高于正常組體重25%以上，根據(jù)肥胖的標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到了肥胖。

表2 高脂飼料喂養(yǎng)各組大鼠體重變化（±s）

表2 高脂飼料喂養(yǎng)各組大鼠體重變化（±s）

注：與正常對(duì)照組比較：＃P＜0.01

組別動(dòng)物數(shù)（只）體重（g）14264.70±8.65糖尿病治療對(duì)照組14342.05±17.78＃糖尿病治療運(yùn)動(dòng)組14338.76±28.06正常對(duì)照組＃

2.2大鼠空腹胰島素、血糖的變化由表3可知，治療糖尿病對(duì)照組空腹胰島素、血糖水平升高且有顯著性差異（P＜0.01）。糖尿病治療運(yùn)動(dòng)組空腹血糖下降（P＜0.05），空腹胰島素下降（P＜0.05）有顯著性差異。

2.3 大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白變化 從表4可知，糖尿病治療對(duì)照組骨骼肌瘦素受體蛋白含量下降有顯著性差異（P＜0.05）；治療運(yùn)動(dòng)組與其相應(yīng)的對(duì)照組比較：骨骼肌瘦素受體蛋白含量升高并有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 空腹胰島素、血糖的變化（±s）

表3 空腹胰島素、血糖的變化（±s）

注：與正常對(duì)照組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；治療運(yùn)動(dòng)組與治療對(duì)照組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)（只）FINS（mmol／l）FBG（mmol／l）144.76±0.4440.94±13.29糖尿病治療對(duì)照組1419.94±2.13＃＃77.42±16.06＃＃糖尿病治療運(yùn)動(dòng)組1411.38±6.66★49.88±14.93正常對(duì)照組★

表4 大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白變化

3 討論

3.1 Ⅱ型糖尿病模型的建立 國(guó)內(nèi)外學(xué)者已證實(shí)，高熱量飲食＋STZ注射是制造Ⅱ型糖尿病大鼠模型的重要條件。小劑量STZ可選擇性損傷胰島細(xì)胞，導(dǎo)致高血糖；高熱量飲食可導(dǎo)致肥胖，肥胖可引起胰島素抵抗，產(chǎn)生高胰島素血癥、血脂紊亂等一系列Ⅱ型糖尿病臨床特征。兩者聯(lián)合作用可以成功誘導(dǎo)出具有高血糖特征和胰島素抵抗的Ⅱ型糖尿病大鼠模型［5－7］。該模型模擬了中老年人經(jīng)典Ⅱ型糖尿病自然病程（使用的STZ劑量以大鼠體重35 mg／kg為最適宜）［8］。

實(shí)驗(yàn)先將糖尿病治療組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周，糖尿病治療組體重與正常對(duì)照組比較明顯升高（P＜0.01），高于正常組體重的25%以上，根據(jù)肥胖的標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)達(dá)到了肥胖。第9周開(kāi)始STZ注射（35mg／kg體重），72h后尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖值＞16.7mmol／L，治療對(duì)照組的血糖和胰島素水平均明顯升高（P＜0.01）?？赡苡捎陂L(zhǎng)達(dá)16周高脂攝食的過(guò)程，致體內(nèi)能量過(guò)剩，糖脂質(zhì)代謝紊亂，肥胖產(chǎn)生的基礎(chǔ)上STZ注射后，胰島素的敏感性下降，胰島素的分泌不足等即胰島素抵抗，胰島素效應(yīng)減低，胰島素介導(dǎo)的肌肉脂肪組織攝取葡萄糖能力降低，同時(shí)肝臟葡萄糖輸出增加，機(jī)體為了維持正常的血糖水平，代償性的胰島素分泌增加，引發(fā)了高胰島素血癥。當(dāng)β細(xì)胞分泌胰島素不能完全代償胰島素抵抗時(shí)，導(dǎo)致β細(xì)胞功能衰竭，胰島素分泌減少，血糖升高，最終發(fā)生了糖尿病。以上結(jié)果表明糖尿病造模的成功。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白表達(dá)的影響 叢琳［9］等對(duì)Ⅱ型糖尿病運(yùn)動(dòng)組的大鼠進(jìn)行12周的跑臺(tái)訓(xùn)練后，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠骨骼肌、肝臟、胰腺等組織的瘦素受體蛋白含量和mRNA水平都顯著增加（P＜0.05），認(rèn)為運(yùn)動(dòng)通過(guò)對(duì)瘦素受體蛋白功能和基因水平的影響介導(dǎo)胰島素代謝和分泌作用的改善，是運(yùn)動(dòng)糾正糖尿病能量代謝失衡的機(jī)制之一。

實(shí)驗(yàn)中各運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行8周自由游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。糖尿病治療運(yùn)動(dòng)組骨骼肌瘦素受體蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），認(rèn)為運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)上調(diào)骨骼肌瘦素受體蛋白表達(dá)，改善瘦素的敏感性，提高瘦素功能、改善瘦素抵抗。機(jī)體Leptin敏感性改善后，促進(jìn)外周組織脂肪酸分解，降低脂質(zhì)在肝臟、骨骼肌、胰腺等外周組織中的聚集，增加肝臟、骨骼肌、胰腺等外周組織利用葡萄糖的能力，從而改善了胰島素抵抗。在一定程度上改善Ⅱ型糖尿病機(jī)體內(nèi)的糖脂代謝紊亂，對(duì)Ⅱ型糖尿病治療起到了有效作用。

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R965

A

1007－8517（2013）16－0043－03

2013.05.29）

高敬賢，女，碩士，從事病理生理學(xué)教學(xué)及科研工作。

白長(zhǎng)喜，教授，博士生導(dǎo)師，從事蒙醫(yī)藥現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的研究。E－mail：changbai2010＠yahoo.com.cn