小鼠胚胎附植研究現(xiàn)狀

陶 俐，苗 凱，安 磊，吳中紅，田見暉

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130118;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

小鼠胚胎附植研究現(xiàn)狀

陶 俐1，2，苗 凱2，安 磊2，吳中紅2，田見暉2

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長春 130118;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

體外胚胎生產(chǎn)效率低以及胚胎質(zhì)量不高已成為制約我國人類生殖輔助技術(shù)以及畜牧業(yè)健康快速發(fā)展的重要因素。胚胎在體外環(huán)境下發(fā)育的基因調(diào)控機(jī)制及附植前后母胎互作機(jī)理不清是其重要原因。因此，對于體外胚胎發(fā)育的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控及母胎對話分子機(jī)制的揭示成為亟待解決的重大科學(xué)問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等研究手段深入探討體外胚胎發(fā)育的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控以及表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制，解析胚胎與母體子宮對話的分子調(diào)節(jié)機(jī)制成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。

小鼠;胚胎;附植

E－mail:Eunice8023@yahoo．cn

胚胎附植是哺乳動(dòng)物繁殖的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，附植前后胚胎內(nèi)部mRNA和蛋白的性質(zhì)和數(shù)量都發(fā)生著復(fù)雜的變化，這些變化構(gòu)成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而母體環(huán)境確保了早期胚胎內(nèi)正常的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，并確保了胚胎與子宮的識(shí)別、信息交流及其在子宮內(nèi)的定點(diǎn)、適時(shí)附植。然而，體外胚胎先天缺失母體環(huán)境，常常造成早期胚胎基因表達(dá)異常，致使胚胎發(fā)育潛力不足和妊娠時(shí)母胎對話紊亂，最終影響了胚胎附植［1～4］。例如體外發(fā)育技術(shù)最為完善的牛，也只有30%～40%成熟卵母細(xì)胞體外受精后可發(fā)育至囊胚［5］。近年來的研究證實(shí)，不同于體內(nèi)母體環(huán)境，體外成熟(IVM)和體外培養(yǎng)(IVC)的環(huán)境及條件影響到許多早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，并影響到了胚胎的發(fā)育及附植。例如，文獻(xiàn)報(bào)道，約30%的體外胚胎犢牛患有巨胎綜合癥(large offspring syndrome，LOS)是由于體外條件下胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)異常造成的［6］。因此，揭示體外胚胎發(fā)育網(wǎng)絡(luò)調(diào)控以及母胎對話分子調(diào)節(jié)機(jī)制成為亟待解決的重大科學(xué)問題。

本文綜述了利用小鼠模型得出的附植相關(guān)早期胚胎發(fā)育調(diào)控、囊胚附植能力和子宮接受附植能力的研究結(jié)果，希望探索母胎對話的神秘機(jī)制，為人類生殖健康和臨床醫(yī)學(xué)以及畜牧業(yè)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 早期胚胎發(fā)育

哺乳動(dòng)物胚胎附植前經(jīng)歷了受精和第1次卵裂及持續(xù)的細(xì)胞分裂、細(xì)胞全能性的建立及緊縮形成桑葚胚、細(xì)胞分化形成囊胚等一系列發(fā)育過程(圖1)［7］，囊胚成熟到一定程度后，從透明帶中孵化出來并逐步獲得了附植能力。成熟囊胚由滋養(yǎng)外胚層、原始內(nèi)胚層和多能性內(nèi)細(xì)胞團(tuán)3種細(xì)胞組成，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化形成各種胎兒細(xì)胞，而滋養(yǎng)外胚層則與母體子宮腔上皮發(fā)生生理聯(lián)系直接參與了附植。

早期胚胎基因表達(dá)受多層次調(diào)控，主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。通過檢測胚胎不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)基因，可為進(jìn)一步研究基因表達(dá)調(diào)控提供依據(jù)。2004年，Hamatani等［8］和Wang等［9］分別利用芯片技術(shù)系統(tǒng)檢測了小鼠體內(nèi)不同發(fā)育階段早期胚胎基因表達(dá)，初步篩選到一大批不同發(fā)育階段差異表達(dá)基因。Wang等［10］利用基因芯片檢測了體外8個(gè)不同發(fā)育時(shí)期胚胎基因表達(dá)情況，并與Wang［9］的體內(nèi)芯片結(jié)果進(jìn)行比較，試圖揭示造成體內(nèi)外胚胎表型差異的分子機(jī)制，但由于其樣本含量較小(20個(gè)桑椹胚，15個(gè)囊胚)，結(jié)果不理想。Kageyama等利用mRNA擴(kuò)增系統(tǒng)及基因芯片技術(shù)對附植前不同發(fā)育階段胚胎轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在1－細(xì)胞和2－細(xì)胞，也就是合子基因組激活(zygotic genome activation，ZGA)時(shí)期表達(dá)變化較大［11］。Goossens等構(gòu)建了2－細(xì)胞和8－細(xì)胞抑制消減雜交文庫，并利用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了部分差異表達(dá)基因，進(jìn)一步利用免疫熒光標(biāo)記從蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證了KRT18，F(xiàn)N1和MYL6三個(gè)基因在附植前不同發(fā)育階段胚胎差異表達(dá)［12］，提出可將這三個(gè)基因作為牛囊胚形成的標(biāo)記基因。

高通量轉(zhuǎn)錄譜的對比研究對解析早期胚胎發(fā)育的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控起到一定積極作用，但這些差異表達(dá)基因與不同階段胚胎差異的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。因此，很多學(xué)者通過單個(gè)基因過表達(dá)或抑制表達(dá)研究基因在早期胚胎發(fā)育中的功能。Sheth等將緊密連接相關(guān)蛋白ZO－1或ZO－2的siRNA顯微注射到合子或2－細(xì)胞胚胎，延遲了囊胚腔發(fā)育［13］。Foygel等利用反義 morpholino寡核苷酸(morpholino oligonucleotide，MO)介導(dǎo)Oct4基因敲降，發(fā)現(xiàn)Oct4敲降的胚胎不能發(fā)育至囊胚，表明該基因?qū)δ遗叩陌l(fā)育至關(guān)重要。作者進(jìn)一步利用芯片技術(shù)檢測了由Oct4調(diào)控的基因表達(dá)，初步推測了其在早期胚胎發(fā)育中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在30多個(gè)受Oct4調(diào)控的基因中，Rest和Mta2在2－細(xì)胞階段受到 Oct4 的嚴(yán)格調(diào)控［14］。

圖1 小鼠附植前胚胎發(fā)育過程(E0－E5)

2 附植的重要生理過程

早期胚胎發(fā)育到囊胚期，進(jìn)入子宮，開始附植(implantation)，這是決定哺乳動(dòng)物繁殖性狀成敗的關(guān)鍵一步，附植成功與否，取決于胚胎和子宮兩個(gè)方面。受精之后，子宮內(nèi)膜和胚胎均發(fā)生了一系列顯著的形態(tài)學(xué)變化，最終子宮內(nèi)膜高度敏感，具備了接受胚胎粘附和侵入的能力，子宮這一可接受囊胚期胚胎附植的狀態(tài)稱為“植入窗口”，亦即窗口期［15～18］。然而，妊娠第4天(以見栓為第1天，妊娠第4天相當(dāng)于E3.5，依次類推)摘除小鼠卵巢誘發(fā)了延遲植入(delayed implantation)，并且將延緩植入的囊胚移植到“植入窗口期”子宮內(nèi)亦不能附植［19］，表明，胚胎植入前還需要經(jīng)歷“激活”過程。同時(shí)，對于附植來說，子宮處于窗口期與激活的囊胚兩個(gè)條件缺一不可。

2.1 附植前后子宮的重要生理變化

大多數(shù)哺乳動(dòng)物，排卵后子宮內(nèi)膜的腔上皮(luminal epithelium)、腺上皮(glandular epithelium)和基質(zhì)(stroma)3種組織均發(fā)生了明顯的細(xì)胞增生。子宮內(nèi)膜細(xì)胞尤其是腺上皮的增生方式及程度表現(xiàn)出一定的種間差異［20～23］。以小鼠為例，臨近排卵時(shí)，腔上皮細(xì)胞有絲分裂達(dá)到峰值，腺上皮個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂，而基質(zhì)細(xì)胞則不分裂。排卵及其稍后的時(shí)間內(nèi)，腔上皮、腺上皮和基質(zhì)均無細(xì)胞增生，排卵后3天，腺上皮細(xì)胞突然出現(xiàn)有絲分裂峰，腔上皮細(xì)胞也出現(xiàn)一個(gè)小的增殖峰。第4天，上皮細(xì)胞增殖現(xiàn)象急劇減少，而基質(zhì)細(xì)胞有絲分裂增多，并持續(xù)至第5天。如果植入失敗，子宮內(nèi)膜細(xì)胞有絲分裂維持在低水平，直到下一個(gè)周期開始。而靈長類動(dòng)物，如果植入失敗，子宮內(nèi)膜迅速退化細(xì)胞發(fā)生凋亡，無植入發(fā)生的子宮內(nèi)膜碎片將以月經(jīng)的形式排出。但一旦胚胎附著，子宮內(nèi)膜變化達(dá)到極致，對囊胚非常敏感并接受其附著。子宮附植的準(zhǔn)備受母體性腺甾類激素(雌激素和孕酮)的調(diào)節(jié)，按照子宮接受胚胎的能力，子宮可分為接受前期、接受期(即窗口期)和非接受期三個(gè)發(fā)育階段(圖2)，窗口期發(fā)生在雌激素峰之后。如果未發(fā)生囊胚植入，則子宮進(jìn)入非接受期。

圖2 小鼠子宮3個(gè)發(fā)育階段

如果囊胚成功植入，子宮內(nèi)膜基質(zhì)則發(fā)生蛻膜反應(yīng)(decidualization)。在與胚胎接觸的子宮內(nèi)膜上形成植入小室(implantation chamber)［25］。小鼠妊娠后5～5.5天，子宮系膜對側(cè)的植入小室周圍形成初級蛻膜帶(primary decidual zone)。初級蛻膜帶中的蛻膜細(xì)胞分化成偽表皮表型，體積增大，細(xì)胞核增多，富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并形成大量的緊密連接、橋粒連接和縫隙連接［26］，當(dāng)胚胎向系膜對側(cè)延伸時(shí)，初級蛻膜帶的蛻膜細(xì)胞開始從植入小室向外發(fā)生凋亡，并被滋養(yǎng)層細(xì)胞吞噬。初級蛻膜帶形成后不久，系膜側(cè)蛻膜形成系膜極(mesometrial pole)。而系膜極的蛻膜細(xì)胞體積較小，只有單個(gè)核，細(xì)胞間存在大量的縫隙聯(lián)接和橋粒聯(lián)接［25］。整個(gè)妊娠期間，蛻膜始終存在。

2.2 附植胚胎的重要生理過程

胚胎附植過程可分為胚胎定向期(apposition)，附著期(Attachment)和侵入期(Penetration)3個(gè)階段［27］。胚胎附植過程發(fā)生在窗口期子宮。

2.2.1 定向期

在小鼠中，由于子宮基質(zhì)水腫、膨大導(dǎo)致的子宮腔體閉合，或因囊胚體積增大，胚胎滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜腔上皮開始接觸。由于動(dòng)物排卵數(shù)目和子宮結(jié)構(gòu)不同，胚胎在宮腔相對位置和滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜的接觸程度存在顯著差異，據(jù)此，可將胚胎植入分為3個(gè)類型:一是中央或表面植入，特點(diǎn)是胚胎體積增大，充滿宮腔，滋養(yǎng)層與內(nèi)膜大面積接觸，胚泡不侵入子宮壁內(nèi)部。代表動(dòng)物包括食肉類、兔形類和某些靈長類動(dòng)物;二是偏心植入，胚泡體積小，而宮腔相當(dāng)大，胚泡深嵌于一側(cè)宮腔上皮的陷凹或腺窩中，胚泡生出微絨毛插入內(nèi)膜上皮細(xì)胞間隙，并侵入內(nèi)膜基質(zhì)。許多嚙齒類動(dòng)物的植入屬于此類型。三是完全侵入植入，胚泡附著于子宮內(nèi)膜后，侵蝕內(nèi)膜上皮，穿透上皮基膜，完全侵入內(nèi)膜基質(zhì)當(dāng)中。胚胎在子宮壁內(nèi)生長發(fā)育。蝙蝠、靈長類中的狹鼻猴、猩猩和人屬于這種類型［28］。

2.2.2 附著期

胚胎定位后，子宮內(nèi)膜上皮和胚胎滋養(yǎng)層接觸程度逐步增強(qiáng)。交錯(cuò)排列的滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表面的微絨毛開始發(fā)生變化，逐漸變得鈍圓而無規(guī)則;與此同時(shí)，部分細(xì)胞質(zhì)形成球狀突起，滋養(yǎng)層細(xì)胞與內(nèi)膜細(xì)胞頂部或側(cè)壁形成一些堅(jiān)實(shí)的半橋粒連接或共胞質(zhì)區(qū)，使滋養(yǎng)層與內(nèi)膜上皮的接觸更趨緊密。子宮內(nèi)膜的上述變化稱為粘附反應(yīng)(attachment reaction)。發(fā)生粘附反應(yīng)同時(shí)，子宮內(nèi)膜的血管通透性增大，胚泡周圍的子宮內(nèi)膜明顯水腫。如果給小鼠靜脈注射大分子染料Chicago blue B，可在子宮植入位點(diǎn)清楚地觀察到染料分子從血管滲出形成的藍(lán)色條帶［29］(圖3)。

圖3 靜脈注射Chicago blue B后的子宮

2.2.3 侵入期

胚泡粘附后，與子宮內(nèi)膜聯(lián)接的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分化成為初級滋養(yǎng)層細(xì)胞(primary trophoblast giant cells)，并分泌降解子宮內(nèi)膜基質(zhì)的蛋白酶，吞噬凋亡的子宮內(nèi)膜細(xì)胞成分，促使胚胎侵入子宮內(nèi)膜基質(zhì)［25］。根據(jù)滋養(yǎng)層及絨毛膜和子宮內(nèi)膜的關(guān)系，胎盤分為上皮絨毛膜型(epithelio－chorial type)、內(nèi)皮絨毛膜型(endothelio－chorial type)、血內(nèi)皮型(haemo－endothelial type)和血絨毛膜型(haemo－chorial type)。除上皮絨毛模型胎盤動(dòng)物外，其它動(dòng)物胚胎均需侵入子宮壁，與母體血管建立緊密聯(lián)系。動(dòng)物胚胎的侵入方式大體歸為以下幾類(圖4)［15］。

圖4 不同物種的胚胎植入方式

3 附植時(shí)胚胎－子宮的信號(hào)通路

雖然附植不同時(shí)期的細(xì)胞事件已經(jīng)比較清楚［15，27］，但對于附植過程分子調(diào)控機(jī)理的研究相對滯后，并且這個(gè)非常復(fù)雜的過程也存在物種差異，因此在哺乳動(dòng)物中建立一個(gè)統(tǒng)一的模型是不現(xiàn)實(shí)的。為深入研究附植機(jī)理，有必要搞清哪個(gè)信號(hào)通路是決定性的，哪個(gè)是互補(bǔ)或?qū)沟?，他們之間是如何相互調(diào)節(jié)的，哪個(gè)信號(hào)通路在正常妊娠時(shí)并無太大作用，而在某些應(yīng)激情況下是重要的。對這些問題的探究對解決女性生殖健康問題同樣有益。

3.1 信號(hào)分子

研究顯示，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、同源框蛋白Hoxa10、Wnt等局部分泌的信號(hào)分子與卵巢釋放的激素以自分泌、旁分泌和臨分泌的方式介導(dǎo)胚胎和子宮的相互作用。

3.1.1 雌激素和孕酮

卵巢釋放的孕酮和雌激素［16］是決定子宮接受能力的重要激素。孕酮對所有哺乳動(dòng)物附植和妊娠都非常重要，而雌激素卻存在種間差異。例如孕酮和雌激素是小鼠和大鼠附植的必要因素，而豬、豚鼠和倉鼠的附植則不需要卵巢分泌的雌激素。雖然小鼠和人雌激素對于附植非常重要，但其在小鼠和人胚胎附植過程中的作用尚不十分清楚［30］。雌激素和孕酮對子宮的影響是通過各自核受體(雌激素受體ER和孕激素受體PR)實(shí)現(xiàn)的。選擇性刪除ER和PR不同亞型的研究顯示，Erα－/－子宮發(fā)育不全，不能支持附植［31］，而Erβ－/－子宮仍然可以發(fā)生附植。有趣的是在人工誘導(dǎo)蛻膜化的Erα－/－小鼠模型中，單靠P4就能使子宮發(fā)生蛻膜反應(yīng)，說明ERα對于胚胎粘附可能是必要的，而對于后續(xù)的蛻膜化并無作用［32，33］。正常子宮中表達(dá)PRA和PRB，缺失PRA和PRB小鼠則表現(xiàn)卵巢和子宮功能異常，進(jìn)而產(chǎn)生雌性不育［34］。

3.1.2 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子LIF是白細(xì)胞介素6家族成員，可與白細(xì)胞介素6信號(hào)傳感器gp130共同結(jié)合到LIF受體上，對子宮附植準(zhǔn)備非常重要。LIF最先在妊娠第4天的小鼠子宮腺體中表達(dá)，然后在附著期囊胚周圍的基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［35，36］，表明 LIF有起始子宮準(zhǔn)備和后續(xù)粘附兩重功能。Lif－/－小鼠囊胚始終處于休眠期而不能附植。目前僅gp130對LIF功能的必要性得到驗(yàn)證［37］，而妊娠過程中LIF行使功能的分子機(jī)制尚不清楚。

3.1.3 同源框蛋白

同源框轉(zhuǎn)錄因子對于子宮的接受能力和植入非常重要。B型同源框基因Hoxa10和Hoxa11在接受期小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并一直持續(xù)到附植后的蛻膜化過程，暗示這兩種同源框基因在子宮接受期、植入和蛻膜化過程中功能的重疊［38～41］。大多數(shù) Hoxa10－/－雌鼠由于基質(zhì)細(xì)胞增殖的減弱及后續(xù)蛻膜化的失敗導(dǎo)致不育［38，40］。而 Hoxa10 對于子宮接受能力并非必不可少，因?yàn)镠oxa10－/－小鼠囊胚可與子宮發(fā)生粘附，而Hoxa10在Lif－/－小鼠中表達(dá)正常。相比之下，Hoxa11－/－小鼠子宮發(fā)育不正常，腺體較少，比Hoxa10－/－小鼠表型更不正常。更重要的是，Hoxa11－/－小鼠子宮不表達(dá)Lif，說明Hoxa11對于子宮接受和后續(xù)的植入能力都至關(guān)重要［42］。人子宮分泌期Hoxa10和 Hoxa11都上調(diào)表達(dá)［43］。不同于Hox，Hmx3屬于另一同源框基因家族，在子宮肌層表達(dá)，基因打靶實(shí)驗(yàn)顯示，Hmx3－/－小鼠胚胎不能發(fā)生附植，原因尚不清楚［44］。同源框基因Msx1僅在接受期子宮上皮中表達(dá)，但囊胚粘附期或子宮非接受期不表達(dá)［45］，Lif－/－小鼠 Msx1的持續(xù)表達(dá)更證實(shí)了其在子宮接受期的重要性。然而，Msx1在接受期人子宮內(nèi)膜卻下調(diào)表達(dá)［46］。

3.1.4 形成素

妊娠過程中 hedgehog(HH)，WNT和BMP(bone－morphogenetic－protein，骨形成蛋白)等形成素備受關(guān)注。子宮中Ihh(Indian hedgehog)、Ptc(HH－binding protein/receptor Patched)及轉(zhuǎn)錄因子Gli1－3等HH信號(hào)通路成員［47，48］參與了子宮接受過程，妊娠第 4天，子宮上皮細(xì)胞中Ihh的表達(dá)依賴于孕酮，同時(shí)基質(zhì)中 Ptc、Gli1和 Gli2上調(diào)表達(dá)。WNT4和BMP2則在附植和附植后發(fā)揮了重要作用。sfrp4是WNT的拮抗劑，與anti－BMP在接受期子宮基質(zhì)中表達(dá)［49］。Wnt4和Bmp2在這一時(shí)期并不表達(dá)，而一旦胚胎附著到子宮上，它們都被激活，同時(shí)其拮抗劑立即消失［49］。Lif－/－小鼠子宮中 sfrp4顯著地下調(diào)，說明WNT信號(hào)通路成員對于附植前子宮的準(zhǔn)備非常重要［45］。Wnt2缺失的小鼠胎出現(xiàn)胎盤缺陷，主要表現(xiàn)為胎盤組織形態(tài)異常，包括水腫、組織結(jié)構(gòu)破壞和積血［50］。Wnt7a在成年雌性動(dòng)物子宮腔上皮表達(dá)，其功能的缺失導(dǎo)致生殖道發(fā)育的不正常及Hoxa10和Hoxa11的缺失。Wnt7a－/－雌性小鼠子宮缺乏腺體，并且子宮基層組織異常，導(dǎo)致不育，說明Wnt7a對正常構(gòu)建子宮細(xì)胞具有重要作用［51］。

3.2 信號(hào)傳遞方式

妊娠時(shí)，子宮和胚胎通過分泌信號(hào)分子相互傳遞信息完成母胎對話，這些信號(hào)分子主要通過旁分泌(Paracrine)、臨分泌(Juxtacrine)和自分泌(Autocrine)3種方式進(jìn)行傳遞。旁分泌的特點(diǎn)是，發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞會(huì)分泌一種特異分子，通過某些方式傳遞給受體細(xì)胞。信號(hào)的發(fā)出者和接受者不必接觸，但必須是異種細(xì)胞。而臨分泌中，信號(hào)的發(fā)出者和接受者相互臨近，細(xì)胞發(fā)出的表面信號(hào)分子直接被接受細(xì)胞表面的相應(yīng)受體所識(shí)別和接受，類似于抗原－抗體反應(yīng)，不需要特異的信號(hào)傳遞。自分泌則是細(xì)胞分泌的信號(hào)分子再傳遞給自身的一種信息傳遞方式，一般靠此種方式進(jìn)行信號(hào)放大。

HB－EGF(Heparin binding epidermal growth factor－like growth factor)是已驗(yàn)證的在小鼠胚胎和子宮上皮發(fā)生粘附之前表達(dá)的基因，并通過旁分泌、臨分泌及自分泌方式調(diào)節(jié)胚胎和子宮的相應(yīng)生理過程，HB－EGF通路調(diào)節(jié)機(jī)制見圖5。

圖5 HB－EGF信號(hào)通路總覽

4 研究胚胎附植的模型

4.1 延遲附植模型

小鼠囊胚一般在妊娠第4.5天進(jìn)行附植，在妊娠第4天早上(9時(shí))切除卵巢則會(huì)導(dǎo)致胚胎進(jìn)入休眠狀態(tài)不發(fā)生附植，這一狀態(tài)被稱作延遲附植，持續(xù)注射孕酮后可維持這一狀態(tài)，如果給小鼠注射雌激素，胚胎會(huì)迅速被激活重新發(fā)生附植［53］。正常情況下也會(huì)發(fā)生延遲附植，例如，小鼠產(chǎn)后排卵并交配，卵子受精發(fā)育到囊胚，但由于母鼠處于哺乳期，仔鼠吮吸乳頭的刺激使囊胚處于休眠期，直到哺乳期過后才會(huì)起始附植。利用基因芯片對休眠期和激活胚胎進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄譜分析表明，細(xì)胞周期、能量代謝、細(xì)胞信號(hào)尤其是HB－EGF信號(hào)通路等許多功能基因都存在差異表達(dá)［54］。

小鼠延遲附植模型對于研究母胎對話機(jī)制，分析基因功能非常重要，與胚胎移植等相結(jié)合，可以建立“休眠胚胎－體外激活－胚胎移植”模型，從而分析某些物質(zhì)對于胚胎激活是否有作用。具體而言:利用延遲附植模型獲取休眠狀態(tài)囊胚，用未知功能物質(zhì)處理胚胎，再將胚胎移植到假孕受體中，如果胚胎發(fā)生附植，則說明該未知功能物質(zhì)可以激活胚胎發(fā)生植入(圖 6)［54］。

圖6 “休眠胚胎－體外激活－胚胎移植”模型

4.2 磁珠模型

母胎對話是諸多基因共同協(xié)調(diào)進(jìn)行的結(jié)果，很難劃分出某一特定基因并對其進(jìn)行功能研究。Paria等2001年建立的磁珠模型解決了這一問題［49］。Paria首先選取和囊胚直徑一樣大小的磁珠，然后和純化的目的蛋白溶液浸潤，使蛋白吸附到磁珠之上，在合適的時(shí)間將磁珠移植到小鼠子宮中(方法與囊胚移植相同)，分析子宮后續(xù)的基因表達(dá)及組織學(xué)變化情況(圖7)［17］。該模型可用于研究特定基因(蛋白)在胚胎附植時(shí)的功能，而屏蔽了其他因素的干擾，為體內(nèi)研究通路機(jī)制提供了途徑。

圖7 磁珠移植

4.3 基因敲除模型

基因敲除模型是研究基因功能的一種常規(guī)模型。2006年，Wang向轉(zhuǎn)基因小鼠(LacZ ROSA26 reporter mice，帶有 LoxP位點(diǎn)的LacZ失活基因)的子宮中注射一定劑量的ADV－Cre(攜帶Cre重組酶的腺病毒)，使子宮中特異組織表達(dá)Cre重組酶，從而證明該方法能使子宮特異組織轉(zhuǎn)基因［55］。Qinghua Liu等利用CHK1敲除鼠研究了該基因在圍附植期的功能，發(fā)現(xiàn)Chk1－/－小鼠發(fā)生圍附植期胚胎丟失［56］。Yoon Jeon等為研究TopBP1基因功能，構(gòu)建了條件敲除的TopBP1缺陷小鼠。TopBP1在染色體附植與DNA損傷應(yīng)答中起重要作用。作者發(fā)現(xiàn)TopBP1缺陷的小鼠傾向于在圍附植期發(fā)生死亡，表明該基因?qū)υ缙谂咛グl(fā)育中的細(xì)胞增殖起著重要作用［57］。

5 結(jié)語

針對胚胎與母體子宮對話分子機(jī)制的探索和研究將有助于體外胚胎生產(chǎn)體系的優(yōu)化和完善，提高體外胚胎妊娠效率，從而減少人工輔助生殖的早期胚胎丟失和后代健康缺陷，改善優(yōu)良種畜的育種和擴(kuò)繁效率、促進(jìn)地方品種和稀缺良種的保種等［1～4］。然而目前為止，利用上述技術(shù)對附植過程的認(rèn)識(shí)主要集中在特定的基因或通路。隨著基因芯片、轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)譜等高通量測序手段的應(yīng)用，人們可以遴選出更多的候選基因和通路，并研究其在母胎對話和附植過程中的作用。更重要的是，這些高通量技術(shù)手段結(jié)合生物信息學(xué)分析，可以更加完整的描述附植過程中各個(gè)基因/蛋白間的協(xié)調(diào)和互作關(guān)系，為母胎對話機(jī)制的研究提供詳盡的參考。近年來，利用人［58，59］、小鼠［9］、豬［60］、牛［61］、羊［62］等物種的早期胚胎或子宮內(nèi)膜已經(jīng)建立了大量的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。此外，近年來，甲基化、miRNA等表觀修飾在胚胎附植和母胎對話過程同樣扮演著重要的角色。Julie Borgel和 Zachary D．Smith等先后建立了小鼠附植前后胚胎的甲基化組數(shù)據(jù)庫［63，64］。Shi－ Jun Hu 和 Ren －Wei Su等分別證實(shí)了子宮內(nèi)膜miRNA的異常表達(dá)是導(dǎo)致小鼠胚胎附植延遲的重要原因［65，66］。隨著信息分析技術(shù)不斷發(fā)展，將轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組等基因(蛋白)表達(dá)數(shù)據(jù)與甲基化或miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，為遴選附植前母胎對話的關(guān)鍵表觀因子或位點(diǎn)，真正深入理解調(diào)控胚胎附植的分子基礎(chǔ)提供了很好的思路。

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S814.3

A

1005－2739(2013)03－0003－10

2013－03－19

陶俐 (1989－)，在讀碩士研究生，專業(yè)方向:動(dòng)物遺傳育種與繁殖。