羅亞坤 程燕
【摘 要】目的建立一種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)的簡便方法。方法以無血清的DMEM培養(yǎng)液灌洗小鼠腹腔,分離獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,在含有10%成牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),臺盼藍(lán)染色計算存活率,瑞氏染色計算純度。結(jié)果 獲得高純度的巨噬細(xì)胞,具備巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征。結(jié)論該方法是一種簡單可行的分離巨噬細(xì)胞的方法。
【關(guān)鍵詞】小鼠;巨噬細(xì)胞;分離;培養(yǎng);鑒定
0.引言
巨噬細(xì)胞是動物機體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞, 具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要作用[1, 2] , 被廣泛應(yīng)用于體外免疫增強藥物的非特異性免疫功能評價[3] 。有很多文獻(xiàn)報到已能從多種組織和器官中分離純化巨噬細(xì)胞,但這些方法大多都是繁瑣、復(fù)雜,所需時間長且耗資較大。本實驗以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象, 探索建立一種巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與鑒定簡便的方法。
1.材料與方法
1.1實驗對象
清潔級巴貝斯小鼠,體重在(30-32g),由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。
1.2實驗方法
1.2.1小鼠腹腔單核巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)
隨機選取巴貝斯小鼠,腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液5ml。輕柔小鼠腹部2-3min,靜置5-7min后將小鼠頸椎脫臼處死,至于解剖板上,無菌條件下打開腹腔,用注射器抽取腹腔液,離心5min (1000r/min),棄上清,用PBS洗滌2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(0.1%雙抗溶液)調(diào)節(jié)至2×106ml-1,接種于培養(yǎng)瓶及6孔板,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h,棄上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2遍,然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)[4]。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.2.2巨噬細(xì)胞的觀察與鑒定
(1)臺盼藍(lán)染色計算存活率。
4%臺盼藍(lán)母液:稱取4g臺盼藍(lán),加少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100ml,用濾紙過濾,4度保存。使用時。用PBS稀釋至0.4%。(也可買Gibco的成品); 胰酶消化貼壁細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,并作適當(dāng)稀釋。染色:細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)溶液以9:1混合混勻。(終濃度0.04%) ; 計數(shù):在三分鐘內(nèi),分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察,死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色,而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。
(2)瑞氏染色計算細(xì)胞純度。
細(xì)胞涂片自然干燥后,用蠟筆在兩端畫線,以防染色時染液外溢。隨后將玻片平置于染色架上,滴加染液3-5滴,使其蓋滿涂片,大約1分鐘后,滴加等量或稍多的II液,用吸耳球輕輕混勻。沖洗:染色5-10分鐘用流水染液,待干。 結(jié)果觀察,將干燥后的血涂片置顯微鏡下觀察。先用低倍鏡觀察涂片,再用油鏡。
2.結(jié)果
2.1小鼠巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)
(1)巨噬細(xì)胞的觀察與鑒定.
巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。如圖1
(2)臺盼藍(lán)染色結(jié)果。
從腹腔分離出來的巨噬細(xì)胞進行臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞的成活率>95%,如圖2
(3)瑞氏染色結(jié)果。
從腹腔分離出來的巨噬細(xì)胞進行瑞氏染色結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞的純度>98%,如圖3
圖1巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)24h觀察 圖2臺盼藍(lán)染色結(jié)果
圖3 瑞氏染色結(jié)果
3.討論及結(jié)論
巨噬細(xì)胞廣泛分布于體內(nèi),它不僅參與非特異性免疫,而且是特異性免疫中一類關(guān)鍵的細(xì)胞,參與集體眾多的生理和病理反應(yīng)過程,如巨噬細(xì)胞的吞噬和消除病原微生物[5],通過加工處理提成抗原,啟動特異性免疫應(yīng)答[6],以及巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡清除吞噬的致病病原體等。由于腹腔巨噬細(xì)胞多游離存在于腹腔的腹水中,易于獲得,因此許多實驗室在進行基礎(chǔ)或配合臨床研究巨噬細(xì)胞功能及其與疾病的關(guān)系、或篩選免疫增強藥物和探討其作用機制時,往往選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對象。
雖然腹腔巨噬細(xì)胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后,吸出含有巨噬細(xì)胞的灌洗液了,但具體操作略有差異[7]。預(yù)先注入的巨噬細(xì)胞刺激劑有淀粉溶液、肉湯、糖原等,以產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞計入腹腔。雖然這些刺激劑能分離收集到大量的巨噬細(xì)胞,但注入的大分子抗原物質(zhì)對巨噬細(xì)胞吞噬功能有一定的影響,獲得的巨噬細(xì)胞已不再是原體內(nèi)巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)功能。本實驗提取巨噬細(xì)胞的方法是對文獻(xiàn)中方法的改進,關(guān)鍵在于活體腹腔注射不含血清的培養(yǎng)液,輕揉腹部后靜置幾分鐘,然后頸椎脫臼致死小鼠,無菌打開腹腔吸取腹腔液[4]。此方法相對處死小數(shù)后進行系列操作而言,洗出的灌洗液中混雜的白細(xì)胞少,提取局勢細(xì)胞的純度高,是一種簡便的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離方法,為巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。
【參考文獻(xiàn)】
[1]徐遠(yuǎn)義,黃允寧,常越,等.多抗甲素誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對癌細(xì)胞殺傷增強機制的研究[J].免疫學(xué)雜志,2006,22(4):396-398.
[2]黃瓊,李志,楊杏芬,等.流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2007,21(2):140-146.
[3]張華,鐘英英,方廖瓊,等.羊胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國生化藥物雜志,2005,26(2):70-72.
[4]李海濤,肖丹,等.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展雜志,2008,8(4):638-639.
[5]SO,IH,T-SH,etal.Rearrangement of action cytoskeletion during infection with Escherichia coli O157 in macrophage[J].Cell Struct Funct,1999,24(5):237-246.
[6]Fulton SA,Reba SM,Pai PK,etal.Inhibition of major histocompatibility complex Ⅱ expression and antigen processing in murine alveolar macrophage by mycobacterium bovis BCG and the 19-kilodalton mycobacterial lipoprotein[J].Infect Immun,2004,72(4):2010-2110.
[7]尹美珍,李世普,等.大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報,2009,31(9):40-42.