小兒咽扁顆粒含量測定方法研究

劉安 秦孝波 黃艷

小兒咽扁顆粒為中藥復(fù)方制劑, 其主要成分為金銀花、射干、桔梗、人工牛黃、麥冬等, 功能：清熱利咽, 解毒止痛。用于肺實熱引起的咽喉腫痛, 咳嗽痰盛, 咽炎喉炎等。其中金銀花為清熱解毒、治療喉痹的主要藥物。金銀花主要成分為綠原酸(花中可達(dá)5 %), 控制其含量十分重要。綠原酸具有抗氧化、抗菌抗病毒、治療心血管疾以及抗癌變、免疫調(diào)節(jié)等作用。通過對不同檢測波長、流動相、提取時間、提取溶劑、提取方法、溶劑用量的試驗以及各種方法的結(jié)果準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的考察, 確定了高效液相方法測定綠原酸含量的可行性, 并選擇出最佳測定方法。

1 試驗材料

試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑, 以乙腈-0.4%磷酸溶液(12：88)為流動相, 柱溫30℃, 流速1.0 ml/min, 檢測波長為385 nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于2000。對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品適量, 加甲醇制成每1 ml含0.084mg的溶液。供試品溶液的制備：精密取本品1 g, 置具塞錐形瓶中, 精密加50%甲醇50 ml, 稱重, 超聲處理20min后, 放冷至室溫, 再次稱重, 用50%甲醇補(bǔ)充減失的重量, 搖勻, 用0.45 μm微孔濾膜濾過, 即得

2 試驗方法及結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇 取綠原酸對照品適量, 用甲醇溶解并稀釋成每1 ml含0.084mg/ml的溶液, 在190 nm～400 nm的波長范圍內(nèi)掃描, 本品在327.8 nm處有最大吸收, 與中國藥典金銀花(含量測定)項下測定波長(327 nm)相近, 為保持一致, 故選擇327 nm作為本品的檢測波長［1］。

2.2 流動相的選擇 流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(12：88)；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；在此條件下綠原酸與其他組分均達(dá)到基線分離, 而且峰形較好。

試驗中曾用以下流動相進(jìn)行試驗：乙腈-0.4%磷酸溶液(13：87)(藥典金銀花《含量測定》項下流動相), 但綠原酸與相鄰峰尚未達(dá)到基線分離。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取時間的考察 精密稱取本品1.000 g(3份), 分別加入甲醇50 ml, 稱重, 分別超聲處理20、30、50min, 放冷,用甲醇補(bǔ)充減失的量, 搖勻, 濾過, 即得。吸取上述供試品溶液10 μl按擬定的條件測定。

2.3.2 提取方法的選擇 精密稱取本品2份：①精密加入甲醇50 ml, 稱重, 分別超聲提取50min, 放冷, 稱重, 用甲醇補(bǔ)充減失的量, 搖勻, 濾過, 即得。②精密加入甲醇50 ml, 稱重, 回流提取50min, 放冷, 稱重, 用甲醇補(bǔ)充減失的量, 搖勻,濾過, 即得。

吸取上述各供試品溶液10 μl按擬定的條件測定, 結(jié)果表明, 超聲20min提取效果較好。

2.3.3 提取溶劑的選擇 精密稱取本品1.0000 g2份：分別加入下表不同溶劑50 ml, 超聲處理20min, 放冷。分別用不同溶劑補(bǔ)充減失的量, 搖勻, 濾過, 即得。

吸取上述各供試品溶液10 μl按擬定的條件測定, 結(jié)果表明, 50%甲醇提取效果較好。

2.3.4 溶劑用量的考察 精密稱取1.0000 g3份：精密加入50%甲醇30 ml、50 ml、60 ml, 稱重, 超聲處理20min, 放冷,稱重, 用50%甲醇補(bǔ)充減失的量, 搖勻, 濾過, 即得。

吸取上述各供試品溶液10 μl按擬定的條件測定, 結(jié)果表明, 50 ml與60 ml提取效果差異較小。

依據(jù)以上測定結(jié)果, 綜合考慮提取效果, 最終選擇50%甲醇50 ml超聲處理20min作為本品的處理方法。

2.4 陰性溶液的制備 依據(jù)上述色譜條件分別吸取供試品溶液、50%的甲醇溶液、對照品溶液各10 μl進(jìn)行測定, 供試品溶液和對照品溶液在相同的保留時間各有一個色譜峰,而50%的甲醇溶液在此保留時間無色譜峰［2］。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液(0.084mg/ml)1 μl、3 μl、6 μl、8 μl、14 μl按已擬定的色譜條件測定峰面積 , 以峰面積積分值為縱坐標(biāo), 綠原酸的量(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計算得回歸方程： y=59.040x-3.8625, r=0.9999。

實驗表明, 綠原酸在0.084～1.176μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度 取綠原酸對照品溶液, 連續(xù)進(jìn)樣5次, 每次6 μl, 記錄色譜圖。結(jié)果表明, 儀器的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液10 μl, 分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣一次, 考察樣品溶液的穩(wěn)定性, 計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差, 結(jié)果表明, 供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性實驗 精密稱取樣品(20071118)五份, 制成供試品溶液, 按擬定的色譜條件測定峰面積, 并計算含量, 計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%, 結(jié)果表明, 本方法的重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率 取已知含量的小兒咽扁顆粒(20071118)五份, 分別添加綠原酸對照品適量, 制成供試品溶液, 按上述色譜條件測定, 按以下公式計算回收率, 結(jié)果表明, 本法具有良好的回收率。

2.10 樣品測定 分別精密吸取供試品溶液各10 μl, 依上述色譜條件測定, 依據(jù)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。根據(jù)以上三批樣品中測得的綠原酸含量, 暫定本品中含金銀花以綠原酸(C16H18O9)計 , 不得低于 0.65mg/g。

3 討論

本品為中藥復(fù)方制劑, 其中金銀花為本品中主要藥物之一。金銀花主要成分為綠原酸, 為進(jìn)一步控制本品的質(zhì)量,選擇綠原酸為含量測定指標(biāo), 采用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸的含量。本品原標(biāo)準(zhǔn)中, 沒有含量測定項, 按此工藝條件制得的成品難已保證確切的療效和均一的內(nèi)在質(zhì)量。為克服這些缺陷, 并對成品的質(zhì)量控制進(jìn)行了提高研究,并建立了綠原酸的高效液相含量測定方法, 使其具備了較詳細(xì)的工藝參數(shù)和質(zhì)量控制指標(biāo), 保證了藥品的優(yōu)良品質(zhì)和確切的臨床療效。

根據(jù)實驗結(jié)果得出實驗結(jié)論為：此方法可以作為控制小兒咽扁顆粒產(chǎn)品的定量分析方法, 而且此方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。

［1］董憲鳳.HPLC法測定精制銀翹解毒片中綠原酸的含量.天津藥學(xué), 2006, 18(4):92.

［2］吳梅青, 劉佳佳.高效液相色譜法測定小兒咽扁顆粒中綠原酸的含量.黑龍江醫(yī)藥, 2007, 30(6):17-18.