綠竹花發(fā)育相關(guān)基因BoAP3的克隆與分析

朱龍飛，徐英武，林新春

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

MADS-box基因家族是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，最先從酵母的轉(zhuǎn)錄因子MCM1、擬南芥Arabidopsis thaliana的AG基因、金魚(yú)草Antirrhinum majus的DEF（DEFICIEMNS）基因和人的轉(zhuǎn)錄因子SRF（SRF4）中鑒定出來(lái)，在決定植物開(kāi)花時(shí)間和花形態(tài)建成中均起著非常重要的作用[1-3]。通過(guò)對(duì)擬南芥和金魚(yú)草的研究，Bowman等[4]提出了花器官發(fā)育的ABC模型，將同源異型基因分成A，B和C等3類(lèi)?；ㄆ鞴俚男再|(zhì)便是由這3類(lèi)同源異型基因所決定。A類(lèi)基因獨(dú)自作用形成萼片，A類(lèi)和B類(lèi)基因共同作用形成花瓣，B類(lèi)和C類(lèi)基因共同作用形成雄蕊，C類(lèi)基因獨(dú)自作用形成雌蕊。APETALA3（AP3）/DEFICIENS（DEF）為植物花器官發(fā)育B類(lèi)基因，調(diào)控植物雄蕊的發(fā)育[5]，AP3及其同源基因根據(jù)其編碼的蛋白質(zhì)C端一段特異序列的不同可以分為3個(gè)基因系：paleoAP3系，eu-AP3系和TM6系[6]。近年來(lái)，AP3同源基因在很多物種中都得到了相關(guān)報(bào)道[7]，但在竹子中沒(méi)有這類(lèi)報(bào)道。竹類(lèi)植物是多年生植物，也是重要的經(jīng)濟(jì)植物，竹子開(kāi)花會(huì)造成竹林成片死亡的現(xiàn)象，對(duì)生態(tài)環(huán)境和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)很大的影響，因此，對(duì)竹子開(kāi)花的研究具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以綠竹Bambusa oldhamii組培苗為實(shí)驗(yàn)材料，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）技術(shù)獲得了BoAP3基因的cDNA全長(zhǎng)，利用生物信息學(xué)對(duì)其進(jìn)行了分析，同時(shí)也對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行了分析，旨在為進(jìn)一步研究竹類(lèi)花發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綠竹花芽和營(yíng)養(yǎng)芽分別來(lái)自浙江農(nóng)林大學(xué)組培室繼代1周的開(kāi)花試管苗和營(yíng)養(yǎng)試管苗[8]，長(zhǎng)度為1 cm左右。采用Trizol法提取其總核糖核酸（RNA），-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 綠竹AP3基因的克隆與序列分析

按照Reverse Transcription System（日本TAKARA公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成花芽cDNA第1鏈。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)搜索（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/），根據(jù)禾本科Poaceae AP3-like同源基因序列由Primer 5.0設(shè)計(jì)一段保守序列引物，上游引物為5′-CGGGGATCATGAAG AAGGCG-3′，下游引物為5′-TCATACTGCTCGATCCATAG-3′，由中國(guó)上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。根據(jù)擴(kuò)增的保守序列設(shè)計(jì) RACE引物，3′RACE第 1輪引物為 5′-TGATATCTGTGCCTGGG CTG-3′，第 2輪引物為：5′-TAGGCTGGTCCCGATGCCCT-3′。 5′RACE 第 1 輪引物為 5′-CCATCATCATGTTCTCCTCC-3′， 第 2 輪引物為 5′-CGCACGGGGATCATGAAGAA-3′。根據(jù)RACE結(jié)果設(shè)計(jì)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）引物，上游引物為 5′-ATGGGGCGCGGCAAG-3′， 下游引物為 5′-TTAACCGAGGCGCAGGTCGC-3′。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增目的條帶采用凝膠回收試劑盒（中國(guó)上海生工）回收。將回收條帶插入pMD-20T載體（日本TAKARA公司），熱激法轉(zhuǎn)化DH5α（日本TAKARA公司），在氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取正向克隆，搖菌過(guò)夜，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切鑒定送到中國(guó)上海生工生物工程服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上BLAST比對(duì)，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列氨基酸編輯（圖1），CLUSTAL軟件采用Neighbor-Joining（NJ）分析方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，在此基礎(chǔ)上用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 綠竹BoAP3基因的定量表達(dá)分析

以提取的綠竹開(kāi)花試管苗的花芽和不開(kāi)花試管苗的營(yíng)養(yǎng)芽為材料，提取總RNA，參照試劑說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用ABI-7500定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀對(duì)綠竹上述部位AP3基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。以綠竹Actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，ABI-7500反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性 15 s，59℃退火 1 min，40個(gè)循環(huán)。Actin上游引物為5′-TGAGCTTCCTGATGGG CAAG-3′， 下游引物為 3′-CCTGATA TCCACGTCGCACTT-5′。 BoAP3上游引物為5′-GGAGGTTCGCCACAGGAA-3′， 下游引物為 5′-GCTCCTGCTGCAGGTTCT-3′。

圖1 BoAP3推定氨基酸序列Figure1 Putative amino acid sequence of BoAP3

2 結(jié)果與分析

2.1 BoAP3序列分析

以禾本科保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到了180 bp的片段，3′RACE擴(kuò)增得到了750 bp的片段，5′RACE擴(kuò)增得到了300 bp的片段，將5′RACE和3′RACE獲得的序列進(jìn)行拼接，結(jié)果顯示：該cDNA全長(zhǎng)為998 bp，含有1個(gè)完整的ORF序列，長(zhǎng)度為654 bp。核苷酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列為AP3同源基因，該基因與水稻Oryza sativa，小麥Triticum aestivum，玉米Zea mays等植物的AP3基因序列有很高的同源性。DNAMAN分析顯示，該片段編碼218個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為25.04 kD，等電點(diǎn)為8.97。Blastp結(jié)果顯示：該蛋白屬于MADS-box家族，具有植物MADS-box蛋白典型的特征，其編碼肽鏈包含2個(gè)保守區(qū)（MADS盒和K區(qū)）和2個(gè)非保守區(qū)（I區(qū)和C區(qū)）（圖1），氨基酸序列與來(lái)自其他單子葉植物的某些MADS盒基因高度同源，與水稻OsMADS16，玉米silky1以及小麥WAP3一致性（identity）分別為83.54%，82.72%和82.30%，與擬南芥AP3的一致性為43.62%。在MADS盒和K區(qū)的氨基酸序列非常保守（圖 2）。在NCBI上查找已經(jīng)克隆出來(lái)的11個(gè)不同物種的AP3同源基因，采用clustalx對(duì)這些基因作氨基酸序列比對(duì)，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（mega 4.0）分析顯示，BoAP3與小麥AP3關(guān)系最近，其次為水稻AP3，與金魚(yú)草DEF同源基因進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，序列分析表明BoAP3蛋白屬于pale-oAP3 系（圖 3）。

圖2 BoAP3與其他物種相關(guān)MADS區(qū)蛋白氨基酸序列比較Figure2 Amino acid sequence comparison of BoAP3 and the related MADS domain proteins of other species

圖3 基于MADS盒基因氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)分析Figure3 Phylogenetic analysis based on the amino acid sequence of MADS-box genes

2.2 BoAP3表達(dá)分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 使用PCR產(chǎn)物作為模板，逐級(jí)稀釋10.0倍，做6個(gè)梯度，制作Actin和BoAP3的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。Actin和BoAP3的擴(kuò)增曲線(xiàn)R2分別為1.000和0.998，表明模板重復(fù)性好，所采用的PCR體系和熱循環(huán)體系條件可以得到穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2.2 BoAP3在花芽和營(yíng)養(yǎng)芽中的表達(dá)水平 以同時(shí)繼代1周的開(kāi)花試管苗的花芽和營(yíng)養(yǎng)試管苗的營(yíng)養(yǎng)芽cDNA為模板，以Actin為內(nèi)參，研究 BoAP3基因在花芽和營(yíng)養(yǎng)芽中的相對(duì)表達(dá)情況（圖4）。每個(gè)模板和引物組合做3個(gè)重復(fù)。每個(gè)引物和模板組合的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)誤差較小，表明重復(fù)性好，且Actin和BoAP3引物擴(kuò)增的Ct值均落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Ct值的區(qū)間。定量結(jié)果表明：BoAP3在花芽的表達(dá)量明顯比營(yíng)養(yǎng)芽高，是營(yíng)養(yǎng)芽表達(dá)量的8.1倍。

圖4 BoAP3基因在綠竹花芽和營(yíng)養(yǎng)芽中的表達(dá)水平Figure4 Expression level of BoAP3 gene in flower buds and vegetative shoots of Bambusa oldhamii

3 結(jié)論與討論

為了探討MADS-box基因調(diào)節(jié)竹類(lèi)花器官發(fā)育的作用，克隆得到綠竹中的AP3-like基因并命名為BoAP3，該基因具有MADS-box中B類(lèi)基因的結(jié)構(gòu)特征。依據(jù)基因C端序列的不同，AP3-like基因分為3個(gè)基因系，分別是paleoAP3系，eu-AP3系和TM6系。本研究中分離的BoAP3蛋白質(zhì)序列與paleoAP3系最相近，具有paleoAP3基序（YGx-HDLRLA）[9-10]（圖2），BoAP3與小麥、水稻等AP3-like同源基因所編碼的氨基酸同源性達(dá)到80%以上，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上聚為一類(lèi)。綜上所述，可以確定BoAP3是B類(lèi)AP3-like基因。

到目前為止，已經(jīng)從多個(gè)物種中克隆得到了花發(fā)育相關(guān)的B類(lèi)基因（圖3），其表達(dá)模式有著顯著的差異。擬南芥中，AP3基因在花器官發(fā)育的第2輪和第3輪表達(dá)[11]，而在金魚(yú)草中DEF基因在花器官發(fā)育4輪中都有表達(dá)，在非花組織不表達(dá)[12]，玉米的silky1基因在花器官所有部位表達(dá)[13]，熒光定量PCR結(jié)果可以看出，綠竹開(kāi)花試管苗花芽的表達(dá)量是不開(kāi)花試管苗營(yíng)養(yǎng)芽表達(dá)量的8.1倍，這一結(jié)果表明BoAP3與花器官發(fā)育有密切關(guān)系。

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