不同破壁方法提取結(jié)核分枝桿菌總RNA的比較

羅影殊 高文鳳 黃偌穎 劉衡川

不同破壁方法提取結(jié)核分枝桿菌總RNA的比較

羅影殊 高文鳳 黃偌穎 劉衡川

目的建立簡(jiǎn)便有效的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）總RNA提取方法>。方法采用5種方法，分別為160、240和400W超聲波聯(lián)合Trizol法（簡(jiǎn)稱(chēng)“160W超聲法”、“240W超聲法”和“400W超聲法”）、玻璃珠（簡(jiǎn)稱(chēng)“玻珠”）聯(lián)合Trizol法（簡(jiǎn)稱(chēng)“玻珠法”）和Trizol法（簡(jiǎn)稱(chēng)“不加玻珠法”），對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進(jìn)行破壁，提取總RNA。通過(guò)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR評(píng)價(jià)不同破壁方法對(duì)Mtb總RNA提取效果的影響，以滅菌超純水代替模板為陰性對(duì)照。每種方法分別提取3份樣本進(jìn)行檢測(cè)。最后結(jié)果為3份標(biāo)本的平均值>。結(jié)果玻珠法檢測(cè)組Ct值為20.67，△Rn值為0.644；400W 超聲法檢測(cè)組Ct值為22.09，△Rn值為0.571；240W超聲法檢測(cè)組Ct值為21.86，△Rn值為0.503；160W超聲法檢測(cè)組Ct值為25.21，△Rn值為0.411；不加玻珠法檢測(cè)組Ct值為28.40，△Rn值為0.299；陰性對(duì)照Ct值為40.00，△Rn值為0.000>。結(jié)論直觀(guān)地從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，玻珠法對(duì)結(jié)核分枝桿菌破壁效果好于超聲法。

分枝桿菌，結(jié)核； RNA，細(xì)菌； 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)； 細(xì)胞壁； 細(xì)菌學(xué)技術(shù)

20世紀(jì)80年代以來(lái)，結(jié)核病再次在全球肆虐，成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)的結(jié)核病疫情形勢(shì)十分嚴(yán)峻，每年新登記的結(jié)核病患者約130萬(wàn)，因結(jié)核病死亡者每年達(dá)13萬(wàn)例?；仡櫺哉{(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)結(jié)核病的誤診率可達(dá)24.1%［1］，提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，促進(jìn)早診斷、早治療是有效控制結(jié)核病蔓延的必要措施。目前，我國(guó)通過(guò)抗酸染色和細(xì)菌培養(yǎng)等方法發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者并監(jiān)測(cè)療效。傳統(tǒng)檢測(cè)方法不利于快速準(zhǔn)確地診斷肺結(jié)核以及療效的評(píng)價(jià)，急需開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)也逐漸應(yīng)用于結(jié)核快速診斷，如免疫學(xué)方法、PCR、核酸雜交等。PCR尤其是熒光定量PCR已作為結(jié)核病診斷的輔助實(shí)驗(yàn)，其中對(duì)DNA的研究頗多［2－3］。但DNA較穩(wěn)定，檢測(cè)存在平臺(tái)效應(yīng)。研究表明，在抗酸染色和痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)陰后仍能檢測(cè)到痰液中的DNA［4－5］。因此，DNA 不能用于結(jié)核分枝桿菌的活菌檢測(cè)。原核生物的mRNA不穩(wěn)定，易降解，半衰期僅為數(shù)分鐘。因此，mRNA可作為活菌檢測(cè)的標(biāo)志物。國(guó)內(nèi)外已有基于mRNA的RT-PCR檢測(cè)活菌的成功報(bào)道［6－8］。

總RNA的提取是mRNA檢測(cè)最為關(guān)鍵的步驟，所得RNA的純度和完整性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁特殊，難以像其他細(xì)菌通過(guò)去污劑或裂解劑裂解，需在常規(guī)RNA提取方法的基礎(chǔ)上輔以超聲波或加玻璃珠（簡(jiǎn)稱(chēng)“玻珠”）等機(jī)械破碎手段。

本課題在異硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法（Trizol法）的基礎(chǔ)上，比較玻珠和不同功率的超聲波對(duì)結(jié)核分枝桿菌的破壁效果，以建立高效的結(jié)核分枝桿菌總RNA提取方法。

材料和方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)菌株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，來(lái)自成都市結(jié)核病防治研究院。

2.主要試劑和儀器：直徑0.5mm玻珠（美國(guó)Sigma公司）；RNAiso Plus、Taq聚合酶［寶生物工程（大連）有限公司］；PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；中性羅氏培養(yǎng)基（博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司）；超聲儀（成都肯格王三氧電器設(shè)備有限公司）和熒光定量PCR儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）。

3.引 物 序 列：上 游 引 物：5′-GACAGACGTGAGCCGAAAGAT-3′；下 游 引 物：5′-GGAAGGACTACAGCCGCTG-3′；分子信標(biāo)探針：5′-FAMCTTGGGGACGCCGATTGATGATCCAAGDABCYL-3′。由寶生物工程（大連）有限公司合成。

二、方法

（一）細(xì)菌培養(yǎng)

用滅菌的接種環(huán)輕輕刮取H37Rv菌落，接種于改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20～25d。

（二）結(jié)核分枝桿菌總RNA提取方法

取5支1.5ml eppendorf（EP）管，各稱(chēng)取0.2g H37Rv菌體，分別標(biāo)記為160W超聲法組、240W超聲法組、400W超聲法組、玻珠法組和不加玻珠法組。各組分別加入1ml Trizol試劑，漩渦振蕩混勻。處理如下：160W超聲法組、240W超聲法組和400W超聲法組－70℃ 放置10min，沸水速融，分別經(jīng)過(guò)160W、240W和400W超聲波處理3次，每次3min，間歇10s。玻珠法組加玻珠（0.2g）；不加玻珠法組不做處理；玻珠法和不加玻珠法組漩渦振蕩器振蕩1min。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入200μl氯仿，振蕩30s，室溫放置10min。4℃，12 000×g離心15min，樣品分為3層，上層（無(wú)色水相）、中間層和粉紅色有機(jī)層；取500μl上層無(wú)色水相于新的EP管中，加入300μl糖原（1000μmol／ml）和500μl異丙醇，室溫10min。4℃，10 000×g離心10min；棄上清，加600μl 75%乙醇，搖勻。4℃，7000×g離心5min。棄去上清，室溫盡量干燥，加入30μl DEPC（diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）水溶解沉淀，保存于－70℃冰箱。如樣本為痰液，則需先進(jìn)行液化再提取RNA。具體步驟為：加2～4倍痰液體積的4%NaOH，漩渦振蕩器混勻，室溫放置20min，12 000×g離心10min，棄上清。加500ml無(wú)菌水，漩渦振蕩器混勻，12 000×g離心5min，棄上清。重復(fù)上次操作。5種方法分別提取3份樣本的總RNA。

（三）RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA

1.總RNA基因組中殘留DNA的去除：為防止總RNA提取液中DNA造成結(jié)果假陽(yáng)性，通過(guò)gDNA Eraser去除上述5種方法提取的總RNA標(biāo)本中的DNA。體系為5×gDNA Eraser Buffer 2μl，gDNA Eraser 1μl，滅菌超純水2μl，總RNA模板5μl，總體積10μl。42℃孵育2min（PCR儀中進(jìn)行）。產(chǎn)物－70℃保存。

2.RNA逆轉(zhuǎn)錄：將上述去除DNA的RNA提取液作為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程（表1）。體系為去除DNA的RNA10μl，滅菌超純水4μl，5×Prime-Script?Buffer 4μl，Reverse Transcription Primer Mix（逆轉(zhuǎn)錄引物混合物）1μl，PrimeScript?RT Enzyme Mix 1μl，總體積20μl。37℃孵育15min，85℃5s（PCR儀中進(jìn)行）。產(chǎn)物可用于熒光定量PCR檢測(cè)，－20℃保存。

3.總RNA中混有基因組DNA的去除效果的測(cè)定：上述5種方法提取的總RNA均按表1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，驗(yàn)證DNA去除效果。陰性對(duì)照以滅菌超純水代替模板。

表1 RNA提取液中DNA去除效果驗(yàn)證試驗(yàn)

4.熒光定量 PCR 檢測(cè)［9］cDNA：RNA 提取液中DNA去除效果驗(yàn)證試驗(yàn)、模擬痰樣本的熒光定量PCR檢測(cè)步驟均按以下操作進(jìn)行。分子信標(biāo)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng)的體系：滅菌超純水 8.65μl，10×Buffer 2.5μl，MgCl26μl，dNTP 1μl，上下游引物各0.5μl，分子信標(biāo)探針0.25μl，Taq DNA聚合酶0.6μl，模板5μl，總體積為25μl。陰性對(duì)照以滅菌超純水代替模板。

反應(yīng)循環(huán)條件為：94℃3min，94℃20s，61℃20s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以熒光定量PCR分析軟件設(shè)定基線(xiàn)和閾值（0.05），得到以循環(huán)數(shù)（Ct值）為橫坐標(biāo)、熒光值（△Rn值）為縱坐標(biāo)的定量擴(kuò)增曲線(xiàn)。Ct值≤38為陽(yáng)性，＞38為陰性。

5.模擬痰樣的制作及檢測(cè)：稱(chēng)取0.2g新鮮培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌體2份，一份加入一定量的正常人痰液中，另一份不做處理。兩份樣本均按玻珠法提取RNA，gDNA Eraser去除DNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)，評(píng)價(jià)所用總RNA提取方法對(duì)模擬痰液中結(jié)核分枝桿菌的提取效率。陽(yáng)性對(duì)照為水煮得到的結(jié)核分枝桿菌H37Rv DNA，陰性對(duì)照以滅菌超純水代替模板。

結(jié) 果

一、總RNA中混有基因組DNA的去除效果

圖1為玻珠法組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。設(shè)定閾值為0.05，可見(jiàn)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組有明顯躍遷，去DNA產(chǎn)物組無(wú)躍遷，說(shuō)明gDNA Eraser可去除RNA提取物中的DNA，且不會(huì)影響RNA的檢出。其余4種方法結(jié)果與玻珠法組相同。因此，gDNA Eraser是有效的基因組去除劑。

圖1 玻珠組熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)gDNA Eraser去除DNA效果的擴(kuò)增曲線(xiàn)圖

二、5種RNA提取方法提取效率的比較

設(shè)定閾值為0.05，玻珠法檢測(cè)組Ct值為20.67（20.83、20.12、21.06），△Rn 值為 0.644（0.653、0.612、0.667）；400W 超聲法檢測(cè)組 Ct值為22.09（22.23、21.85、22.19），△Rn 值為 0.571（0.573、0.557、0.584）；240W 超聲法檢測(cè)組 Ct值為21.86（21.78、21.26、22.54），△Rn 值為 0.503（0.500、0.516、0.493）；160W 超聲法檢測(cè)組 Ct值為25.21（25.34、25.40、24.89），△Rn 值為 0.411（0.403、0.400、0.431）；不加玻珠法檢測(cè)組 Ct值為28.40（28.22、28.02、28.96），△Rn 值為 0.299（0.299、0.313、0.284）；陰性對(duì)照Ct值為40.00，△Rn值為0.000。玻珠法檢測(cè)組Ct值最小，表明在5種RNA提取方法中，加玻珠破壁提取結(jié)核分枝桿菌總RNA效果最好。圖2為其中的1次結(jié)果。

圖2 5種結(jié)核分枝桿菌RNA提取方法提取效率的擴(kuò)增圖譜

三、模擬痰樣檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)玻珠法提取的模擬痰樣組和未處理組結(jié)核分枝桿菌總RNA，結(jié)果如圖3所示。模擬痰樣組Ct值（28.93）略大于未加痰液組（25.57），說(shuō)明玻珠法能有效提取模擬痰樣中的結(jié)核分枝桿菌總RNA。

圖3 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)模擬痰樣擴(kuò)增曲線(xiàn)圖

討 論

對(duì)于特殊生物樣本，如組織、革蘭陽(yáng)性菌和真菌等，單獨(dú)使用異硫氰酸胍－酚－氯仿法并不能有效裂解細(xì)胞，導(dǎo)致RNA提取效率降低。因此，提取組織、革蘭陽(yáng)性菌和真菌等生物樣本的RNA時(shí)，需在化學(xué)裂解細(xì)胞的基礎(chǔ)上輔助其他手段。如提取組織RNA常在Trizol（總RNA抽提試劑）前加入液氮中機(jī)械研磨，使組織充分分散破碎［10］。革蘭陽(yáng)性菌多采用加入溶菌酶使細(xì)胞壁水解［11］。真菌RNA的提取可在Trizol的基礎(chǔ)上輔助碾磨、超聲波或玻珠等機(jī)械破碎方法［12－13］。

結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁特殊，堅(jiān)韌性較強(qiáng)，含有大量分枝菌酸、阿拉伯半乳糖成分，多糖和磷脂含量豐富。單純使用Trizol法提取結(jié)核分枝桿菌RNA較困難。由于結(jié)核分枝桿菌可通過(guò)空氣傳播，不適用液氮研磨；細(xì)胞壁中脂質(zhì)含量高，對(duì)溶菌酶有一定的抗性。已報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌總RNA提取方法中，Gill等［14］報(bào)道加入玻珠可提高提取效率；劉根焰［15］研究發(fā)現(xiàn)，超聲波能破碎結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁，可得到用于PCR檢測(cè)的較高純度和質(zhì)量的總RNA。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較玻珠和不同功率超聲波聯(lián)合Trizol法，對(duì)結(jié)核分枝桿菌總RNA的提取方法進(jìn)行優(yōu)化。

通過(guò)熒光定量RT-PCR Ct值比較各實(shí)驗(yàn)組RNA提取效率。結(jié)果顯示，超聲波組RNA Ct值小于Trizol組，說(shuō)明超聲波有助于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的破裂。不同功率試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著功率的增大，結(jié)核分枝桿菌RNA提取效率有一定程度的提高；但240W和400W組熒光定量RT-PCR Ct值接近，提示當(dāng)功率增大到一定程度，超聲波對(duì)細(xì)菌的破碎效果可能達(dá)到平臺(tái)期。玻珠組RNA Ct值小于超聲波組，可能是玻珠振蕩對(duì)結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的破碎作用大于超聲波；也可能是超聲波在破碎細(xì)菌的同時(shí)會(huì)對(duì)RNA造成一定程度的斷裂。另外，玻珠法不需要特殊儀器，優(yōu)于超聲波法，更利于推廣。模擬痰樣檢測(cè)結(jié)果也表明，玻珠法可有效提取痰液中結(jié)核分枝桿菌總RNA。

綜上所述，玻珠聯(lián)合Trizol法能夠快速、高效地提取結(jié)核分枝桿菌總RNA，有利于建立基于mRNA的熒光定量RT-PCR快速檢測(cè)活結(jié)核分枝桿菌。

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The comparison of different wall-breaking method for extracting total RNA ofMycobacterium tuberculosis

LUO Ying-shu＊，GAO Wen-feng，HUANG Ruo-ying，LIU Heng-chuan.＊Department ofMedical Technology，West China School ofPublic Health，Sichuan University，Chengdu 610041，China

：LIU Heng-chuan，Email：lhc54＠sohu.com

ObjectiveTo establish a simple and effective total RNA extraction method ofMycobacterium tuberculosis. Methods Cell wall ofMycobacterium tuberculosiswere treated by ultrasonic and glass-bead associated with Trizol method respectively，the total RNA was extracted and the influence of different total RNA extraction methods of Mtb were evaluated through fluorescent quantitative RT-PCR.The negative control is ultrapure water instead of template.Each method were extracted from 3samples for testing.The final result is the average of 3specimen. Results The Ct and△Rn value of glass-bead group is 20.67and 0.644，400Wultrasonic group is 22.09and 0.571，240Wultrasonic group is 21.86and 0.503，160Wultrasonic group is 25.21and 0.411，bead absent group is 28.40and 0.299，negative control is 40.00and 0.000. Conclusion The wall-breaking effection of glass-bead method is better than that of ultrasonic method.

Mycobacterium tuberculosis； RNA，bacterial； Reverse transcriptase polymerase chain reaction；Cell wall； Bacteriological techniques

610041成都，四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教研室（羅影殊、黃偌穎、劉衡川）；四川省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制所（高文鳳）

劉衡川，Email：lhc54＠sohu.com

2012-10-31）

（本文編輯：張曉進(jìn)）