抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊有效部位正交設(shè)計(jì)

韓淑英， 張博男， 包巨太， 儲(chǔ)金秀， 余 紅， 馬會(huì)霞， 李 潔

（河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山 063000）

抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊有效部位正交設(shè)計(jì)

韓淑英， 張博男， 包巨太*， 儲(chǔ)金秀， 余 紅， 馬會(huì)霞， 李 潔

（河北聯(lián)合大學(xué)，河北唐山 063000）

目的 優(yōu)化抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊提取分離有效部位的最佳配伍。方法 提取分離抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊的有效部位 （乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提部位）為三因素，擬定1、2、3三個(gè)劑量水平，通過三因素三水平的正交試驗(yàn)表L9（34）安排試驗(yàn)，以感染抗柯薩奇B3親心肌病毒 （CVB3）小鼠死亡率為觀察指標(biāo)，考察三個(gè)組分的配伍關(guān)系，并優(yōu)選配伍劑量。用優(yōu)選的新復(fù)方治療CVB3性心肌炎小鼠，進(jìn)行多指標(biāo)的藥效學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果正交試驗(yàn)結(jié)果表明正丁醇部位為影響藥效的主要因素；優(yōu)選的最佳配伍是正丁醇部位高劑量、水提部位中劑量和乙酸乙酯部位低劑量組合 （即A1B3C2），三者的配伍比例是A∶B∶C=1∶15.17∶14.83，給藥量是原方的1/7～1/6。進(jìn)一步藥效學(xué)多指標(biāo)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，新組方對CVB3心肌炎小鼠死亡率、心重指數(shù)和血清酶活性均有降低作用，并能減輕心肌組織病理損傷程度；新組方中、高劑量組效果更好，但二者之間無差異，二者均好于原方水煎組。結(jié)論 正交試驗(yàn)優(yōu)選的有效部位組方是正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水提部位，三者的配伍質(zhì)量比是1∶15.17∶14.83，新組方優(yōu)于原方水煎。

正交試驗(yàn)；抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊；有效部位；配伍；柯薩奇B3親心肌病毒；心肌炎

抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊是治療病毒性心肌炎的臨床驗(yàn)方，由黃芪、西洋參、萊菔子、五味子、麥冬、王不留行、丹皮七味藥材組成，有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)益心氣、保護(hù)心肌等作用，臨床證明該方不僅可以改善癥狀，穩(wěn)定病情，而且可以縮短病程，減少復(fù)發(fā)［1］。但抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊臨床用量較大，給患者帶來了不利。為改進(jìn)上述缺點(diǎn)，進(jìn)一步從組分層次探討抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究制備了抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊的不同提取部位，用正交試驗(yàn)篩選出有效組分及最佳組分配伍方案，為制備療效好、應(yīng)用方便的新型組分復(fù)方制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料

1.1 藥物與試劑 西洋參、黃芪、丹皮、麥冬、五味子、萊菔子、王不留行 （抗柯薩奇B病毒性心肌炎原藥材）均購自石家莊市柏林藥材公司，經(jīng)河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院韓剛教授鑒定；D101大孔樹脂 （天津海光化工有限公司）；谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST）試劑盒 （批號：20100111）和乳酸脫氫酶 （LDH）測定試劑盒 （批號：20100111）均購自南京建成生物工程研究所；病毒唑 （廣州市市橋藥業(yè)有限公司，批號：20091006）。

1.2 病毒和細(xì)胞株 柯薩奇B3親心肌病毒（CVB3）由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥所惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室－70℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?；Hep－2細(xì)胞由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥所惠贈(zèng)。CVB3病毒在Hep－2細(xì)胞中傳代，反復(fù)凍融3次，測定得其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量 （TCID50）為10－3.66/mL，分裝后于－70℃凍存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周雄性近交系Balb/c小鼠，清潔級，體質(zhì)量 （20±2）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證號為SCKX（京）2009－0004。

1.4 主要儀器 電子調(diào)溫電熱套 （天津市泰斯特儀器有限公司，型號：98-1-B）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-5205）；電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號：GZX-9070 MBE）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司，型號：HH-6）；MP200A型電子天平（上海第二天平儀器廠）。酶標(biāo)儀 （BIO-RAD），2123TC CO2培養(yǎng)箱 （美國），XDS-1B型倒置式生物顯微鏡 （china），YXQ.DY-250高速蒸汽滅菌器 （上海核醫(yī)療儀器廠），THZ-82B型汽浴恒溫振蕩器 （江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

2 方法

2.1 抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊方有效部位的提取與制備 按處方比例 （西洋參100 g，黃芪100 g，麥冬50 g，萊菔子20 g，王不留行13 g，五味子50 g，丹皮66 g）稱取各藥材，加10倍量80%乙醇，回流提取3次，每次2.0 h，合并提取液，濾過，減壓回收乙醇。藥液濃縮后用D101大孔吸附樹脂進(jìn)行分離富集，經(jīng)過乙酸乙酯洗脫3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙酸乙酯洗脫液，干燥后得到乙酸乙酯部位（A）；樹脂再用正丁醇洗脫3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)正丁醇洗脫液，干燥后得到正丁醇部位 （B）；醇提后的藥渣，水煎煮3次，加水量分別10、8、8倍，每次1.5 h，合并水煎液減壓濃縮，加乙醇至含醇量60%，放置過夜，離心，取沉淀，用等體積95%乙醇清洗2次，減壓干燥，得到水提部位（C）。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)分析法［2-3］按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各部位配伍，同時(shí)考慮與總方、陽性藥物對比，篩選各成分的較好組合（配伍）。確定影響作用較大的成分，篩選較優(yōu)配伍。

2.2.1 因素水平的確定 3個(gè)提取組分 （部位）構(gòu)成3種因素 （A、B、C），計(jì)算每一組分按每付藥提取量，將該每付藥提取量視為相當(dāng)人臨床用量，小鼠有效量為人臨床用量（g/kg）的8倍，以此為中劑量，其0.5倍為低劑量，2倍為高劑量。擬定1、2、3（低、中、高）三個(gè)劑量水平，通過三因素三水平的正交試驗(yàn)表L9（34）安排試驗(yàn)，以死亡率為考察指標(biāo)，考察三個(gè)組分的配伍關(guān)系，并優(yōu)選配伍劑量。見表1。

表1 因素水平

2.2.2 動(dòng)物分組及給藥 按三因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（34）小鼠應(yīng)分9組，每組20只。根據(jù)人與小鼠的標(biāo)準(zhǔn)kg體質(zhì)量劑量折算方法［2-3］，換算得小鼠的各組分每日用量 （表1）。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日各組小鼠腹腔接種 CVB3病毒液0.2 mL，其CVB3病毒接種量為兩倍半數(shù)致死量 （LD50）（預(yù)先測得小鼠LD50為1.6×10－6滴度）。小鼠在隔離實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，于接種病毒當(dāng)日按表2分組，各組灌胃相應(yīng)藥物配伍給藥，每天1次，連續(xù)21 d。

2.3 優(yōu)選新組方驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)［2-3］對正交優(yōu)選的有效部位組方，觀察其對病毒性心肌炎小鼠的治療作用，進(jìn)一步驗(yàn)證其抗柯薩奇B病毒性心肌炎的效應(yīng)。BALB/c小鼠，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、病毒唑組、原方水煎組和新組方高、中、低治療組，每組20只。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日正常對照組腹腔接種細(xì)胞培養(yǎng)液0.2 mL，其他組小鼠腹腔接種CVB3病毒液0.2 mL，小鼠 CVB3病毒接種量為 0.8LD50（1.3×10－6滴度）。小鼠在隔離實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，于接種病毒當(dāng)日安各組灌胃相應(yīng)藥物給藥，每天1次，連續(xù)10 d（正常和病毒模型對照組灌胃同體積的生理鹽水）。給藥第10天小鼠經(jīng)眼球采血，用全自動(dòng)生化分析儀測定血清心肌酶AST和LDH。小鼠取血后迅速開胸取出心臟 （除去大血管、結(jié)締組織，用濾紙吸干表面血液），稱定質(zhì)量并計(jì)算質(zhì)量指數(shù)，之后取心臟置10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察心肌病理變化，并計(jì)算心肌病理積分：即每張切片取上、下、左、右、中5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個(gè)視野面積之比［4］，無病變計(jì) 0分，病變面積﹤ 25%計(jì) 1分，25%～50%計(jì)2分，50% ～75%計(jì)3分，﹥75%計(jì)4分。結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel表建庫整理后，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。用因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 正交試驗(yàn)中R為各因素的極差，由表2可見B因素R值最大，其次是C，再次是A因素。表3結(jié)果顯示，B因素的F值最大為主要因素對結(jié)果有顯著影響 （P＜0.05），C因素的F值次之，綜合分析認(rèn)為最佳配伍是正丁醇部位高劑量、水提部位中劑量和乙酸乙酯部位低劑量組合，既A1B3C2。

表3 方差分析

3.2 優(yōu)選新組方對CVB3心肌炎小鼠治療作用的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

3.2.1 新組方對小鼠一般狀況的影響 以上述正交試驗(yàn)的最佳配伍為基礎(chǔ)，既A1B3C2組合 （既三者的配伍比例是A∶B∶C=1∶15.17∶14.83）為給藥中劑量（0.029+0.44+0.43=0.899 g/kg），中劑量 ×0.5為低劑量 （0.4495 g/kg），中劑量 ×2為高劑量 （1.798 g/kg）。結(jié)果顯示正常組小鼠活動(dòng)、毛色正常、體質(zhì)量增加；各實(shí)驗(yàn)組自第3天起出現(xiàn)活動(dòng)減少，攝食下降，聳毛，蜷縮，皮毛稀疏無光澤，消瘦等癥狀；新組方組、病毒唑組和原方水煎組小鼠生存狀態(tài)較模型組有明顯改善，各組死亡情況見表4。

3.2.2 新組方對CVB3小鼠心質(zhì)量指數(shù) （體質(zhì)量/心質(zhì)量）的影響 表5顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低，心質(zhì)量及心質(zhì)量指數(shù)明顯增高 （P＜0.01）。各藥物治療組小鼠心質(zhì)量指數(shù)明顯低于模型組，其中新組方中、高劑量組與病毒唑組相近，新組方低劑量組與原方水煎組相近。新組方有明顯量效關(guān)系，但高、中劑量組間無明顯差異 （P＞0.05）。

表4 小鼠死亡統(tǒng)計(jì)

表5 小鼠體質(zhì)量 （BW）、心質(zhì)量 （HW）、心質(zhì)量指數(shù)（±s）

表5 小鼠體質(zhì)量 （BW）、心質(zhì)量 （HW）、心質(zhì)量指數(shù)（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與病毒唑組比較，■P＜0.05；與原方水煎組比較，★P＜0.05；與新組方低劑量組比較，P＜0.05，P＜0.01。

組 別 劑量/（g·kg－1） 例數(shù)/只 體質(zhì)量/g 心質(zhì)量 /mg 心質(zhì)量指數(shù)/（mg·g－1）正常對照組20 21.86±2.03 89.65±14.82 4.17±0.36模型對照組 15 18.44±2.16* 113.48±21.27* 6.27±0.61＊＊病毒唑組 0.03 17 19.73±2.05 98.28±21.33 5.15±0.48＊＊▲原方水煎組 6.00 17 20.01±2.12 109.67±20.37* 5.42±0.45＊＊▲新組方低劑量組 0.449 5 17 19.23±1.94 107.33±20.82 5.59±0.45＊＊▲新組方中劑量組 0.899 18 20.57±1.88 97.74±19.28 4.83±0.47＊＊▲■★新組方高劑量組 1.798 19 21.18±1.97 92.48±21.16▲ 4.42±0.49▲＊★

3.2.3 新組方對CVB3小鼠血清AST、LDH的影響 表6結(jié)果顯示，模型組小鼠AST和LDH明顯高于正常對照組（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物治療組血清AST和LDH有不同程度的降低，其中新組方中、高劑量組AST和LDH活性最低，二者之間無差異，且均好于原方水煎組。

表6 各組小鼠血清LDH、AST水平變化（±s）

表6 各組小鼠血清LDH、AST水平變化（±s）

注：與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與新組方低劑量組比較，#P＜0.05。

組 別 劑量/（g·kg－1） 例數(shù)/只 AST/（U·mL－1） LDH/（U·L－1）正常對照組20 74.6±11.3 1 083±128模型組 15 138.4±31.5＊＊ 1 930±216＊＊病毒唑組 0.03 17 113.8±22.8＊＊ 1 540±174＊＊原方水煎組 6.00 17 118.6±19.5＊＊ 1 655±236＊＊▲▲新組方低劑量組 0.449 5 17 121.1±20.9＊＊ 1 758±207＊＊新組方中劑量組 0.899 18 108.5±26.4＊＊▲▲ 1 474±220＊＊▲▲#新組方高劑量組 1.798 19 114.3±21.6＊＊▲ 1 573±185＊＊▲▲

3.2.4 新組方對CVB3心肌炎小鼠心肌病理組織積分的影響 光鏡下見模型組小鼠心肌內(nèi)出現(xiàn)小血管炎，大量心肌變性、壞死，炎性細(xì)胞浸潤，呈現(xiàn)典型的病毒性心肌炎改變；各藥物治療組小鼠心肌病變較模型對照組明顯減輕，各組病理積分 （炎性浸潤及壞死）見表7和圖1。

表7 各組小鼠心肌組織病理積分（±s）

表7 各組小鼠心肌組織病理積分（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 劑量/（g·kg－1） 例數(shù)/只 炎性浸潤/分 壞死/分正常對照組20 0 0模型組 15 2.33±0.44 1.55±0.46病毒唑組 0.03 17 2.05±0.38 1.01±0.24▲▲原方水煎組 6.00 17 2.16±0.35 1.25±0.36▲新組方低劑量組 0.449 5 17 2.27±0.29 1.17±0.30▲▲新組方中劑量組 0.899 18 2.05±0.24▲ 1.04±0.25▲▲新組方高劑量組 1.798 19 1.91±0.35▲▲ 0.98±0.27▲▲

圖1 心肌組織HE染色光鏡照片（×200）Fig.1 Myocardial HE staining Light micrograph（×200）

4 討論

病毒性心肌炎 （Viral myocarditis）已成為臨床的常見病和多發(fā)病，其中柯薩奇B3病毒是導(dǎo)致人類心肌炎的最主要的因素，病毒的感染和復(fù)制可迅速引起嚴(yán)重的心功能紊亂，嚴(yán)重地危害人類健康［5］。前期臨床應(yīng)用和大量實(shí)驗(yàn)研究證明抗柯薩奇B3病毒性心肌炎膠囊對病毒性心肌炎具有良好的治療效果［6］。實(shí)驗(yàn)研究顯示抗柯薩奇B3病毒性心肌炎膠囊提取物及其提取組分有抗氧化、抗應(yīng)激、免疫增強(qiáng)和對心肌損傷具有保護(hù)作用［7-8］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，用抗柯薩奇B3病毒性心肌炎膠囊復(fù)方中提取分離的活性部位為研究對象，按正交試驗(yàn)方法，以CVB3心肌炎小鼠死亡率為指標(biāo)，對各提取組分組合進(jìn)行優(yōu)化篩選。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以正丁醇部位高劑量和水提部位中劑量和乙酸乙酯部位低劑量配伍組小鼠死亡率最低，同時(shí)顯示正丁醇部位是主要因素，其次是水提部位。進(jìn)一步將優(yōu)選的新組分處方進(jìn)行藥效多指標(biāo)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示新組方 （乙酸乙酯部位 ∶正丁醇部位 ∶水提部位組合比例為1∶15.17∶14.83）對小鼠死亡率、心質(zhì)量指數(shù)和血清酶活性均能降低，并能減輕心肌組織病理損傷程度，降低壞死面積，其中新組方中、高劑量組效果最好，但二者之間無差異，且均好于低劑量組和原方水煎組。

病毒性心肌炎至今尚無特效治療藥物。西藥雖有干擾素、腫瘤壞死因子等用于治療病毒性心肌炎，但效果均不理想，常有不同程度的不良反應(yīng)，且價(jià)格昂貴［9-10］。中醫(yī)藥治療該病有一定優(yōu)勢，抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊治療病毒性心肌炎具有良效，但該藥的有效成分或有效部位群等都不明確，且臨床應(yīng)用劑量較大。為解決這些缺點(diǎn)和不足，本研究從該全方藥材中提取分離了有效組分，通過試驗(yàn)對有效組分進(jìn)行優(yōu)化組合，得到由活性成分組成的新型中藥復(fù)方。與原復(fù)方相比，富集了有效組份，不僅服用量小 （約為原方用量的1/7～1/6），而且提高了療效，符合中醫(yī)用藥特色的現(xiàn)代復(fù)方新藥，為明確藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。中醫(yī)用藥的特色之一是復(fù)方用藥，將來源于不同原料藥材的有效成分組成復(fù)方即“有效組分群”［11-13］用于臨床，不僅體現(xiàn)了中醫(yī)藥特色，而且提高了技術(shù)含量，使中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有可控性，也是中藥現(xiàn)代化和國際化的需要。研究中藥有效部位特別是以有效組分群為原料、開發(fā)各種劑型的新藥，已成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。

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R285.5

B

1001-1528（2013）04-0823-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2013.04.045

2012-09-04

國家“十一五”規(guī)劃科技重大專項(xiàng)課題 （重大新藥創(chuàng)制）（2009ZX09103-442）

韓淑英 （1959—），女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥防治心血管疾病。Tel：（0315）3725870，E-mail：shuyinghan59@126.com

*通信作者：包巨太 （1957—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥治療病毒性心肌炎。Tel：（0315）3725030，E-mail：baojutai@sohu.com