BABL/c小鼠感染大腸桿菌O127模型的建立及TGF－β1因子的熒光定量檢測

劉一，隋麗華，曾林，宋宏立，武際榮，陳旖，趙彥斌，劉冰，孫兆增*，王新

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109;2.軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，北京 100071;3.青島農(nóng)業(yè)大學海都學院，山東萊陽 265200;4.青島農(nóng)業(yè)大學校醫(yī)院，山東 青島 266109)

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF－β1)幾乎作用于所有細胞，其生物學活性十分廣泛，對于細胞有促進其增殖和增強活性的作用，亦有趨化作用［1］。TGF－β1作為一種轉(zhuǎn)化生長因子具有免疫抑制、促進間質(zhì)來源細胞的增殖和功能并能誘導許多包括單核細胞、中性粒細胞在內(nèi)的多種細胞趨化，這表明其在多種炎性反應(yīng)中起到重要作用［2－4］。小腸結(jié)腸炎是一種常見的腸道疾病。目前腸炎性結(jié)腸炎模型的建立方法繁多，模型建立成功的鑒定方法標準多但存在檢測不敏感、檢出率底、檢出周期長等特點。建立一種新型快捷的檢測方法將會為動物模型的建立創(chuàng)造方便。本實驗通過灌胃的方式建立腸炎性小鼠模型，運用熒光定量PCR方法觀察TGF－β1在腸炎性反應(yīng)中的表達特點，以期更進一步了解 TGF－β1與組織器官發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為熒光定量在腸炎性小鼠動物模型檢測提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌O127由本室保存，SPF級BALB/c小鼠36只，體重19～21 g，雌雄各半，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供［SCXK(軍)2007－004］，Trizol(Invitrogen，Life Technologies Corporation，美國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連寶生物)，SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara，大連寶生物)，引物由 Invitrogen公司合成，實驗于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心動物實驗室進行［SYXK(軍)2007－004］。

1.2 方法

1.2.1 菌落計數(shù)

復(fù)蘇保存菌種 O127，挑取單菌落，37℃過夜培養(yǎng)。利用培養(yǎng)細菌并10倍遞增稀釋，取1.0×106，1.0×107倍稀釋液涂布 LB固體瓊脂平板各兩塊，37℃過夜培養(yǎng)，記錄菌落數(shù)。求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算原始菌液中的菌體濃度。

1.2.2 建立動物模型

36只小鼠隨機分成6組，分別經(jīng)灌胃給予不同劑量的大腸桿菌，灌胃前禁食24h。1組劑量5×107個，2組劑量 2.5×108個，3組劑量 5×108個，4組劑量2.5×109個，5組劑量5×109個，對照組給予相同劑量的生理鹽水。每隔6h觀察小鼠形態(tài)并記錄，72 h后采集結(jié)腸組織并保存處理。

1.2.3 總RNA的提取及cDNA的合成

取采集的結(jié)腸組織50～100mg，用液氮研磨至粉末狀，立即放入1 mL Trizol(Invitrogen公司，TRIzol Reagent試劑)，按照試劑說明書操作。用ND2100微量核酸蛋白定量測定儀測定RNA濃度和A260/280值，判斷其質(zhì)量。cDNA的合成按照試劑盒說明書操作(Takara公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒)。5 × PrimeScript buffer 4 μL，Prime Script RT Enzyme MixⅠ 1 μL，Oligo dT Primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，Total RNA(1000ng/濃度)，RNase Free dH2O 13－VRNA，總體積 20 μL。反應(yīng)條件，37℃30 min，85℃ 7 s。獲得 cDNA 分裝后于 －20℃保存。

1.2.4 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上公布的鼠TGF－β1序列設(shè)計引物，其上游引物序列為:5’－ggataccaactattgcttcagtcc－3’，下游引物序列為:5’－aggctccaaatataggggcagg gtc－3’。內(nèi)參 gapdh 引物上游序列為:5’－actccactcacggcaaattcg－3’，下游序列為:5’－ggcctcaccccatttgatg－3’。引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.5 實時熒光定量PCR條件優(yōu)化

根據(jù)Takara公司提供試劑盒反應(yīng)條件設(shè)計實驗。樣本 cDNA 2 μL，TGF－β1 上下游引物各 1(0.3～1)μL gapdh上下游引物各 1(0.3～1)μL，2×Taq PCR 10 μL，加水補充至 20 μL 體積。反應(yīng)條件:擴增曲線圖繪制，預(yù)變性 95℃1 min;變性 94℃ 40 s，退火(50～62)℃ 40 s循環(huán)40次;溶解曲線圖繪制，95℃1 min;58℃1 min;58℃循環(huán)123次(每隔0.3℃采集一次熒光信號)，至94.6℃。在該過程中確定最佳反應(yīng)體系，最佳反應(yīng)退火溫度。

1.2.6 制作標準曲線

將標準品按濃度梯度5倍倍比稀釋，利用上述反應(yīng)體系與條件，進行熒光定量PCR實驗，獲得兩種基因的標準曲線。

1.2.7 樣品檢測及統(tǒng)計學分析

利用優(yōu)化條件對樣品進行檢測。設(shè)無DNA模板的陰性對照。利用所得Ct值跟標準曲線圖計算拷貝數(shù)。運用SAS軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間差異應(yīng)用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腸炎性小鼠模型的建立

觀察發(fā)現(xiàn)各實驗組與對照組相比，精神萎靡，被毛蓬亂，實驗組小鼠均不同程度的出現(xiàn)稀便、軟便。解剖發(fā)現(xiàn)實驗組2組、3組、5組部分小鼠結(jié)腸部有出血斑。依據(jù)常規(guī)腸炎性小鼠模型建立標準的大體形態(tài)學和損傷標準判定實驗動物模型成立。

2.2 總RNA提取結(jié)果

提取的樣品總RNA用ND2100微量核酸蛋白定量測定儀測定RNA濃度和A260/280值。各組樣品的A260/280值在1.8～2.0之間，純度較好，可使用。取稀釋過的RNA樣品6 μL，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1)，28S、18S兩條條帶清晰完整，說明提取的總RNA質(zhì)量可靠無降解。

注:M:DL2000分子質(zhì)量標準;1～8:不同組隨機抽取RNA樣本。圖1 小鼠結(jié)腸組織提取RNA電泳結(jié)果圖Note:M:DL2000 DNA marker;1 －8:RNA extracted from the colon tissue of the miceFig.1 The results of electrophoresis of the total RNA extracted from the colon tissue of the mice

2.3 實時熒光定量PCR條件優(yōu)化結(jié)果

引物用量為 0.4 μL，總體系20 μL;退火溫度為gapdh 58℃，TGF－β158℃。

2.4 熒光定量標準曲線

1.0 E+9，2.0E+8，4.0E+7，8.0E+6，1.6E+6五個濃度梯度倍比稀釋。由軟件給出所繪圖可以得出:所作 TGF－β 標準曲線斜率為 －3.352，r2為0.996，擴增效率為 98.8%;內(nèi)參 gapdh斜率為－3335。r2為0.995，擴增效率為99.5%。由此可見兩個基因的擴增效率良好，此次實驗結(jié)果準確可信(如圖2)。

2.5 試驗樣品統(tǒng)計

通過分析發(fā)現(xiàn)，實驗組 TGF－β1的表達水平明顯升高。實驗組之間無明顯差異，與對照組有明顯差異。其中P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

注:A.TGF－β1標準曲線圖;B.gapdh標準曲線圖;C.TGF－β1溶解曲線;D.gapdh溶解曲線。圖 2 TGF－β1、內(nèi)參 gapdh 標準曲線Note:A.The linearity of the standard curves for TGF－β1，B.The linearity of the standard curves for gapdh;C.The solubility curve of TGF－β1;D.The solubility curve of gapdh.Fig.2 The standard curves of TGF－β1 and gapdh

腸炎性動物模型的建立方法主要有免疫學方法，化學刺激法，物理刺激法及復(fù)合法［5］。模型建立的檢測方法亦有多種，主要有免疫組化、血清學、分子生物學等。這些檢測技術(shù)存在檢測不敏感、檢出率低、發(fā)病率低、檢出周期長等不足。本實驗通過菌液灌胃的方法亦成功建立腸炎性動物模型，并利用熒光定量PCR法鑒定機體TGF－β1因子的變化檢測模型的建立情況，從而確定動物模型建立。

熒光定量PCR是指通過熒光染料或特異性熒光探針，對PCR反應(yīng)進行實時定量檢測，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對結(jié)果進行分析，計算待測樣品初始模板量的定量分析方法［6］。與常規(guī)PCR方法相比，實時熒光PCR擴增和檢測過程一步完成，簡化了試驗操作步驟，減小了試驗誤差，且靈敏性高。近年來熒光定量PCR技術(shù)漸近成熟，其在一些難以檢測的疾病及病毒病、細菌病及寄生蟲病的檢測中應(yīng)用廣泛［7－9］。其轉(zhuǎn)基因動物實驗?zāi)Ｐ蜋z測中應(yīng)用較多［10，11］。我們利用其誤差小，檢測靈敏，檢測機體細胞因子的表達量差異，從而準確、快速的確定實驗動物模型的建立成功與否。

TGF－β1作為一種有效的免疫抑制劑能夠抑制各類淋巴細胞增殖和發(fā)揮作用，并具有促進間質(zhì)來源細胞的增值和功能。其在炎性反應(yīng)中具有顯著變化。對于小鼠腸炎性動物模型建立過程中，由于炎性反應(yīng)會導致TGF－β1在結(jié)腸組織中的表達量發(fā)生變化，通過檢測其相對表達量可以快速、簡便的確定動物模型的建立。

實驗通過建立腸炎性動物模型模擬腸炎并通過熒光定量PCR技術(shù)檢測機體中TGF－β1的表達量。通過實驗得出菌液灌胃方法建立動物模型耗時相對較短，檢測較為迅速，且與解剖結(jié)果基本相符。實驗中還發(fā)現(xiàn) TGF－β1在各實驗組都有升高，而各實驗組比較會發(fā)現(xiàn)不同劑量的實驗組隨著濃度的增加先降低再升高，是否有一定的規(guī)律性還需要進一步驗證。本實驗結(jié)果明顯，為以后通過利用實時熒光PCR來檢測機體某些因子表達量來檢測動物模型建立提供了有力依據(jù)。

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