特異區(qū)段替換小鼠性發(fā)育表型的研究

張婷婷，仝莉，肖君華，李凱，周宇荀

(東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

性發(fā)育(puberty)是哺乳動物個體性成熟并獲得生殖能力的過程，以哺乳動物生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)中的下丘腦－垂體－性腺軸(HPGA)［1］的再次激活為標(biāo)志，受到遺傳、環(huán)境等多種因素的影響，但其確切的分子機(jī)制尚不明確。

近年來，很多人利用小鼠對性發(fā)育機(jī)制進(jìn)行研究［2］。2004 年，PaLmert［3］運(yùn)用染色體替換(chromosome substitution strains，CSS)技術(shù)來研究雌性小鼠的性發(fā)育機(jī)制［4，5］。他們通過雌鼠陰道口開啟時間有差異的兩個近交系A(chǔ)/J和C57BL/6J(B6)構(gòu)建染色體替換系［6，7］，觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng) A/J小鼠的 6號或13號染色體替換進(jìn)B6小鼠的基因組后，產(chǎn)生的替換品系雌鼠的陰道口開啟時間比B6明顯提前，而X染色體的替換沒有上述的表型差異。2006年，Thomas等在 PaLmert前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，在6號染色體替換系小鼠中構(gòu)建了同類系小鼠，利用連鎖分析在6號染色體遠(yuǎn)端確定了一個與陰道口開啟相關(guān)的 QTL位于 D6Mit59至末端的區(qū)段內(nèi)(60－75cM)［8］。2008年，本實驗室利用 C3H 和 B6雌鼠性發(fā)育啟動時間差異較大的小鼠品系開展了性發(fā)育啟動相關(guān)基因的研究，在X染色體上發(fā)現(xiàn)了一段與性發(fā)育相關(guān)的 QTL，并將此 QTL定位到(DXMit68－rs29053133)2.5cM 的區(qū)段內(nèi)［9］。

利用上述實驗結(jié)果，分析 A/J，C3H和 B6小鼠在X染色體 DXMit68－rs29053133區(qū)段內(nèi)的 DNA序列，發(fā)現(xiàn)A/J與 C3H約有96%的同源性，而與 B6有80%的序列不一致。是否A/J與C3H較小的序列差異對性發(fā)育的表型差異做出了貢獻(xiàn)?為了驗證我們的推測，將A/J與 C3H小鼠進(jìn)行了6次回交，將A/J的這段序列替換到C3H的X染色體上，觀察替換雌鼠的陰道口開啟時間［10］，卵巢形態(tài)，生長曲線與親本C3H是否有差異，以確定兩親本之間的序列差異是否影響這一表型;另外，利用小鼠全基因組掃描芯片觀察替換小鼠的背景純化程度，并通過11個SNP位點進(jìn)一步對替換區(qū)段精確定位，最終確認(rèn)X染色體 rs13483712和 rs29038106之間(ChrX:9129480－ChrX:69503547)的區(qū)段，沒有與性發(fā)育相關(guān)的候選基因。

其研究結(jié)果將從基因水平揭示性發(fā)育啟動的個體差異機(jī)理，有助于對個體發(fā)育過程以及相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)作用機(jī)理的研究，并藉此為切入點為各類性發(fā)育疾病的治療提供理論基礎(chǔ);同時，對哺乳動物性發(fā)育啟動調(diào)控機(jī)制的了解，可以幫助人們對畜牧品種進(jìn)行有效改良，達(dá)到縮短生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)量的目的，具有明顯而重要的現(xiàn)實與理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級8周齡A/J小鼠雌雄各5只，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司繁殖飼養(yǎng)供應(yīng)【SCXK(滬)2008－0016】，SPF級 8周齡 C3H 小鼠雌雄各 5只，由中科院上海生命科學(xué)研究院上海實驗動物中心所提供【SCXK(滬)2007－0005】。實驗在東華大學(xué)實驗動物設(shè)施內(nèi)【SYXK(滬)2008－0059】進(jìn)行。

1.2 特異區(qū)段染色體替換

利用A/J與C3H小鼠進(jìn)行雜交，得到F1代，繼續(xù)與C3H小鼠回交產(chǎn)生各種雜合子，通過分型，篩選出的XAXC繼續(xù)與C3H回交4代后，觀察F6代雌鼠的性發(fā)育表型(見圖1)。

1.3 性發(fā)育表型分析

圖1 染色體替換體系Fig.1 The chromosome substitution system

鑒定不同品系小鼠性發(fā)育啟動的時間需要一個快速便捷而且可靠的方法，目前公認(rèn)的研究小鼠性發(fā)育的性狀鑒定指標(biāo)之一是雌性小鼠陰道口開啟(vaginal opening，VO)時間的觀察［11］。自雌鼠個體斷奶之日開始，每天監(jiān)測其性發(fā)育的情況，觀察雌鼠陰道是否開啟，并稱量體重，記錄發(fā)育時體重及發(fā)育天數(shù)。通過雌鼠三種基因型 XAXA，XCXC，XAXC陰道口開啟觀察，進(jìn)行均值分析。

自個體出生次日起直至所有雌鼠進(jìn)入有規(guī)律的動情周期的第68天，每隔兩天對小鼠稱重，對F6代三種基因型雌鼠制作生長曲線，并對其體重進(jìn)行均值分析。

卵泡的發(fā)育是一個以形態(tài)變化為特征的生長過程。在卵泡的成熟發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞周圍形成卵泡腔，并逐漸變大，直至包圍在卵母細(xì)胞周圍，最終卵母細(xì)胞從卵泡中排出［12，13］。在雌鼠發(fā)育過程中卵巢的形態(tài)隨之發(fā)生著相應(yīng)的變化。本實驗中，我們對A/J，C3H，XAXC20日齡與45日齡雌鼠卵巢進(jìn)行切片制作［14］，觀察三種基因型在不同時間段卵巢的形態(tài)［15］。

1.4 分型鑒定

1.4.1 基因組DNA的提取

DNA提取采用鼠尾裂解法提取方法［16］。以0.8%瓊脂糖凝膠電泳確定DNA質(zhì)量和濃度，－20℃保存。

1.4.2 PCR引物設(shè)計

所有新設(shè)計的引物均用 Primer3在線軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設(shè)計，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用來分型的位點為 rs29058196 和 YG－atp11c－gata，前者:上游引物CCAAATTCAGGACCTCGTGT，下游引物:TCCTT－GAAAGGCATAAAATACTCA，產(chǎn)物大小:163 bp;后者:上游引物:FAM－CCTCAGAAAGGAGGTGT，下游引物:CAGTGTTCCCCAGCTTTCTC，產(chǎn)物大小:245 bp(見表1)。

表1 測序引物Tab.1 The sequencing primers

1.4.3 PCR

PCR反應(yīng)終體積(15 μL)包括3.4 μL雙蒸水，1.5 μL 10 × PCR buffer(含 34 mmol/L Mg2+)，3 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，2.4 μL 上下游引物(2 μmol/L)，1U TaqDNA 聚合酶(1 μL)和 3 μL DNA 模板(10～15 ng/μL)。PCR反應(yīng)程序為:93℃變性90 s，93℃ 變性 30 s，57℃ 退火 30 s，65℃ 延伸 2 min，40 個循環(huán);65℃保持10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性。PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.4.4 LDR－PCR 分型

LDR－PCR 反應(yīng)終體積(10 μL)包括雙蒸水:4 μL，10 × LDR buffer:1 μL，Probe(位點特異探針、通用熒光探針、通用模板各 1 μmol/L，TaqDNA ligase(40 units/μL):0.1 μL，PCR 產(chǎn)物:4 μL。LDR 反應(yīng)程序為94℃ 30 s，60℃ 2 min，共35個循環(huán);10℃forever。LDR結(jié)束后，取1μL LDR產(chǎn)物在377測序儀上進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳結(jié)束后，利用軟件提取泳道數(shù)據(jù)。LDR探針為:rs29058196 與 YG－atp11c－gata，前者 探針序列為:rs29058196_modify GTGTAAAGTAGAGACAAGGTTT TTTCGCAAACCTGTACTC、rs29058196_CTTTTTCAGATCAACAATCATCG、rs29058196_TTTTTTTTCAGGATCAAAACATGCA，產(chǎn)物大小為:81(A/J)/83(C3H);后者探針將其PCR產(chǎn)物直接在377測序儀上進(jìn)行電泳檢測，產(chǎn)物大小為:246(A/J)/242(C3H)，設(shè)計的探針由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 全基因組掃描與測序分析

為了檢測小鼠回交后X染色體替換進(jìn)入的A/J區(qū)段以及替換后的基因背景是否單一，本研究對替換系的雜合子C3HC3H—XAXC進(jìn)行全基因組芯片掃描。為了更進(jìn)一步縮小替換區(qū)段的距離，本研究在基因芯片初步定位的前期工作基礎(chǔ)上選取X染色體ChrX:9129480－ChrX:132751198區(qū)段作為測序?qū)ο蟆腘CBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站進(jìn)入小鼠基因組的數(shù)據(jù)庫，選取在此區(qū)段內(nèi)A/J和C3H品系小鼠中表達(dá)不同的SNP位點，共計選取SNP位點11個(見表2)，并對其位點引物設(shè)計(見表1)，PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司利用測序儀器ABI－PRISM3730型全自動序列分析儀進(jìn)行測序。

表2 本實驗中選擇的SNP位點Tab.2 SNP markers selected in this study

2 結(jié)果

2.1 F6代雌鼠表型鑒定數(shù)據(jù)結(jié)果

2.1.1 陰道口開啟時間

對F6代各同類系雌性小鼠陰道口開啟年齡進(jìn)行均值分析。對發(fā)育啟動時各同類系小鼠平均體重以及各自的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行分析，并對各特異性區(qū)段小鼠個數(shù)以及籠數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(見表3)。

表3 各品系陰道口開啟時間Tab.3 Timing of vaginal opening(VO)in the mouse strains

如表3所示，A/J純系與C3H純系陰道口開啟時間有顯著性差異 P=0.034091(P＜0.05);而純合子 C3HC3H與雜合子 C3HC3H－XAXC陰道口開啟時間沒有顯著性差異 P=0.6431(P＞0.05)，發(fā)育體重統(tǒng)計學(xué)分析與陰道口開啟時間一致。

2.1.2 生長曲線

對F6代各特異性區(qū)段雌性小鼠及純系A(chǔ)/J小鼠自出生次日起直至全部進(jìn)入動情周期的第68天每隔兩天記錄一次體重，并對其進(jìn)行均值分析。

圖2 各品系生長曲線Fig.2 Growth curves of the mice of different strains

如圖2所示，A/J純系相對生長速度比較緩慢，而C3H與C3H－XAXC的生長趨勢基本相同。這和2008年本實驗室報道相符［9］，這一區(qū)段沒有與體重相關(guān)的調(diào)控基因。

2.1.3 卵巢切片結(jié)果

如圖 3所示(封二)，20日齡時，A/J－1大部分處于次級卵母細(xì)胞時期，而 XAXC－2和 C3H－3大部分處于初級卵母細(xì)胞時期，45日齡時，A/J－4有小部分處于次級卵母細(xì)胞時期，大部分處于黃體時期，同樣 XAXC－5和 C3H－6多處于黃體時期。

A/J與XAXC和 C3H在20日齡時卵巢形態(tài)有著明顯的區(qū)別，而XAXC與C3H在20日齡時沒有顯著差異;45日齡時三者卵巢形態(tài)差別不大，發(fā)育基本成熟，產(chǎn)生黃體，并具有生殖能力。

2.2 對特異區(qū)段染色體替換小鼠(雜合子C3HC3H—XAXC)全基因芯片掃描

對替換系雜合子 C3HC3H—XAXC的1到19號以及X染色體進(jìn)行全基因組掃描，共掃描1448個位點，純和位點1431個，雜合位點17個，其中一個雜合子在X染色體上。

掃描結(jié)果顯示各染色體雜合子只占全基因組掃描位點的1.17%，雜合度只有0.22，說明替換系絕大部分以C3H為背景。其中6號染色體的雜合子排除了2006年，TD Krewson定位的 QTL:D6Mit59至末端區(qū)段內(nèi)(60－75cM)的作用。在掃描的位點中，X染色體第一個點 ChrX:9129480是一個雜合子，ChrX:132751198以后發(fā)生了重組。陰影部分為C3H背景，其中黑色部分為本實驗室之前所發(fā)現(xiàn)的與性發(fā)育有關(guān)的 QTL，從而初步確定了一個范圍(Rs:13483712－Rs:3697188)為替換進(jìn)入的 A/J區(qū)段，隨后繼續(xù)在這段中選取SNP位點測序進(jìn)一步縮小區(qū)段(見表4，圖4)。

2.3 通過測序找出A/J與C3H的邊界

在ChrX:9129480－ChrX:1327511之間平均選取11個位點，找出這11個位點的 SNP，設(shè)計引物，對純系 A/J，C3H以及 F6代替換系 C3HC3H—XAXC做PCR，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果如下。

測序結(jié)果顯示，我們找出了相鄰較近的一個雜合子ChrX69503547與一個純合子ChrX:71294513，為了進(jìn)一步縮小陰影部分的范圍，在這兩個點之間平均找到 ChrX:70009137，ChrX:70275426，ChrX:70739765三個位點繼續(xù)測序，但是測序結(jié)果顯示這三個位點A/J與C3H是無差異的，所以將區(qū)段邊界定位到 ChrX:69503547－ChrX:71294513之間，從而得出 A/J替換到 C3H中的位置:ChrX:9129480－ChrX:69503547，最終將其范圍縮小到了10～60cM之內(nèi)(見表5，圖5)。

表4 基因芯片數(shù)據(jù)Tab.4 Data obtained with gene chip assay

圖4 X染色體替換Fig.4 X chromosome replacement

表5 SNP位點的測序Tab.5 Sequencing of the SNP loci

圖5 測序邊界Fig.5 Sequencing boundary

3 討論

3.1 小鼠家系構(gòu)建方法的選擇

本實驗選擇A/J和C3H近交系小鼠作為構(gòu)建特異區(qū)段替換小鼠的親本，是因為PaLmert等人在A/J與 B6 X染色體替換小鼠中，未發(fā)現(xiàn)與性發(fā)育有關(guān)的QTL;而本課題組用B6和C3H近交系小鼠構(gòu)建的F2代家系中，發(fā)現(xiàn)了一段與性發(fā)育有關(guān)的QTL，因此，在這一 QTL中，A/J和 C3H的序列差異很有可能是導(dǎo)致小鼠性發(fā)育表型差異的原因。

3.2 性發(fā)育啟動相關(guān)鑒定指標(biāo)結(jié)果討論

表型結(jié)果顯示，在不同特異性區(qū)段中，其X染色體上目標(biāo)QTL［17］為 A/J特異性區(qū)段小鼠的三種表型鑒定指標(biāo)(陰道口開啟，卵巢切片，體重)在該QTL中無顯著差異，證明 A/J和 C3H在這一 QTL中染色體的序列差異，沒有引起相關(guān)性狀的顯著差異。我們推測造成這種現(xiàn)象的原因有三種:首先是因為環(huán)境的影響［18］，由于在不同的實驗中，小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境，季節(jié)，參與比較的小鼠每窩只數(shù)和母鼠各不相同，使實驗結(jié)果不太一致［19－21］。其次，小鼠的基因背景的不同，PaLmert等［22］的研究是以B6為背景，而本研究以C3H為背景，在不同的基因背景下，可能存在不同的基因直接相互作用，也導(dǎo)致了性狀的差異。第三，因為A/J和C3H在這一區(qū)段中序列很相似，而與B6差距很大，可能AJ和C3H小部分不一致的序列內(nèi)的基因是不發(fā)揮作用的。

3.3 候選基因的預(yù)測

本實驗對特異性區(qū)段替換小鼠將X染色體定位于 ChrX:9129480－ChrX:69503547區(qū)段內(nèi)。結(jié)果顯示，A/J和C3H在這個QTL區(qū)段中有序列差異的基因不是在這兩個品系小鼠中引起性發(fā)育表型差異的候選基因［23－25］。根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫信息，此目標(biāo)QTL區(qū)段內(nèi)共有123個基因，其中111個基因 A/J和C3H在這一區(qū)段中沒有序列上的差異，而12個基因有序列差異，它們分別是:DynLt3、Srpx、Rpgr、Srpx、Gm14493、Mid1ip1、SLc9a7、Dock11、ELf4、Enox2、Gm15482、Gabre，這些序列的差異沒有引起相關(guān)性狀的明顯差異，所以我們排除了這些基因參與性發(fā)育啟動的調(diào)控。

注：a. A/J 20日齡；b.XAXC 20日齡；c. C3H 20日齡；d. A/J 45日齡；e. XAXC 45日齡；f. C3H 45日齡的卵巢切片。圖3 卵母細(xì)胞形態(tài)Note: a. A/J 20 days; b. XAXC 20 days; c. C3H 20 days; d. A/J 45 days; e. XAXC 45 days; f. C3H 45 days.Fig.3 Morphology of the oocytes in the ovarian tissues.

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