結(jié)直腸腺癌組織中細絲蛋白A的表達變化及意義

馬紅獻，劉勤英，史建偉，張利眾，李 中

(1淶源縣醫(yī)院，河北保定074300;2河北大學附屬醫(yī)院;3保定市第一醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，5年生存率為50%～60%［1］。患者生存預后不佳的重要原因是腫瘤的局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。細絲蛋白A(FLNa)是細絲蛋白家族的重要成員，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖和遷移，與細胞骨架形成、細胞形狀動態(tài)改變以及抵抗細胞外破壞性機械壓力有關(guān)［2］。近期我們采用免疫組化法檢測了結(jié)直腸腺癌組織及正常黏膜組織中FLNa蛋白的表達情況，并分析FLNa蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，探討其在結(jié)直腸癌患者預后中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 46例標本均隨機選取自河北大學附屬醫(yī)院2005年1月～2006年12月的結(jié)直腸癌手術(shù)患者的蠟塊標本。其中男27例，女19例;年齡34～80歲，平均58歲。癌組織取自癌灶中心處，正常黏膜組織取自距癌灶邊緣至少10cm處。全部入組病例均經(jīng)病理檢查確診，且其他器官無原發(fā)腫瘤，無放、化療及免疫治療史，均有完整的臨床及隨訪資料。隨訪截止日期為2011年7月。

1.2 FLNa蛋白表達檢測方法 應用免疫組化SP法檢測結(jié)直腸腺癌組織及正常黏膜組織中FLNa蛋白的表達情況，試劑盒購于中杉金橋公司，單克隆兔抗人FLNa一抗購自Epitomics公司。DAB顯色劑購自Tiangen公司。嚴格按免疫組化試劑盒說明書進行操作，PBS溶液取代一抗著色作為陰性對照，正常人子宮組織染色作為陽性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 FLNa蛋白分布于細胞胞質(zhì)。于高倍鏡下選取5個視野，每個視野觀察約200個細胞，統(tǒng)計細胞陽性率:著色顆粒分為不明顯、稀疏、一定量和彌漫性等4種級別;著色程度分淡染、淡黃、棕黃和棕褐。對每張切片的陽性率及染色強度進行綜合分析:陽性細胞＜25%，染色較淡，無明顯著色顆粒者判定為“-”;陽性細胞在25%～＜50%，染色淡，著色顆粒稀疏者為“+”;陽性細胞在50%～75%，染色棕黃，具有一定量著色顆粒者定為“++”;陽性細胞數(shù)≥75%，染色棕褐，著色顆粒彌漫者定為“+++”。由2名高資質(zhì)臨床病理醫(yī)師共同閱片，確定最終判定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。FLNa在正常組織和癌組織表達情況比較采用χ2檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型，F(xiàn)LNa表達陰性與陽性者生存分析采用Kaplan-Meier法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

FLNa蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中表達-為24例，+為12例，++為10例，陽性率為47.8%，正常組織中﹣為4例，+為5例，++為13例，+++為24例，陽性率為92.3%，兩組FLNa蛋白表達陽性率比較，P=0.000(χ2=41.559)，見圖1。將患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位(結(jié)腸與直腸)、腫瘤侵潤深度(侵及漿膜與未侵及漿膜)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)及FLNa表達(陽性與陰性)等因素引入Cox回歸模型進行多因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤浸潤深度及FLNa表達是影響結(jié)直腸腺癌術(shù)后患者預后的獨立因素(表1)。FLNa表達陽性與陰性者的中位生存時間分別為63、26個月，F(xiàn)LNa蛋白陰性表達者的死亡風險是陽性表達者的3.856倍，其95%的可信區(qū)間為7.326～19.421。兩組生存率的Log-rank檢驗提示差異有有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，生存曲線見圖2。

圖1 結(jié)直腸腺癌組織及正常組織中FLNa蛋白的表達(SP×200)

表1 46例患者的多因素分析

圖2 FLNa表達情況與生存期分析

3 討論

FLNa蛋白主要分布于細胞胞質(zhì)，其基因結(jié)構(gòu)保守，廣泛表達于哺乳動物的組織器官中，對組織器官形成發(fā)育具有重要功能。FLNa蛋白二聚體亞基的長度約80 nm、相對分子質(zhì)量約280 kD，兩條相同的多肽鏈于羧基端相連接，形成的“V”型同源二聚體具有生物學功能。FLNa蛋白的棒狀結(jié)構(gòu)域中含有多重β-片層結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為多種具有重要功能的蛋白質(zhì)間的相互作用提供了平臺，并且其中的多數(shù)蛋白質(zhì)是細胞信號分子的膜受體，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷徙、黏附等多種生物學行為［2］。

目前有關(guān)FLNa與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性的研究較少。史建偉等［3～5］通過研究FLNa蛋白在60例結(jié)直腸癌患者的癌組織及其正常結(jié)直腸黏膜組織的表達情況，并結(jié)合臨床資料進行分析，發(fā)現(xiàn)FLNa蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中的陽性表達率為50.0%，而在正常結(jié)直腸黏膜組織的陽性率為91.7%，差異有統(tǒng)計學意義。FLNa的低表達與結(jié)直腸腺癌的肝轉(zhuǎn)移、腸壁的浸潤深度、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān);經(jīng)脂質(zhì)體成功將FLNa cDNA轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌SW480細胞，過表達FLNa基因后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa能夠抑制SW480細胞的體內(nèi)、體外侵襲能力，其作用機制與MMP-9的表達水平降低有關(guān)。本研究亦發(fā)現(xiàn)，癌組織中的FLNa蛋白表達明顯低于正常黏膜組織，進一步的多因素分析發(fā)現(xiàn)FLNa是結(jié)直腸腺癌患者術(shù)后生存的獨立影響因素，生存分析表明FLNa蛋白低表達患者的生存時間明顯短于FLNa蛋白高表達患者。

有關(guān)FLNa抑癌的機制目前尚不完全清楚。Fiori等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與表達FLNa的 M2A7細胞相比，受表皮生長因子(EGF)刺激后，缺失FLNa的M2細胞中表皮生長因子受體酪氨酸的泛素化水平較低。進一步深入研究證實，F(xiàn)LNa蛋白的缺乏可影響泛素連接酶c-Cb1鏈與表皮生長因子受體相互作用，細胞中抗表皮生長因子誘導的表皮生長因子受體降解受到明顯的抑制，但在表達FLNa的細胞中表皮生長因子受體的降解卻非常活躍，因此推測FLNa可能通過下調(diào)表皮生長因子受體的活性，對腫瘤細胞的增殖具有抑制作用。Zhu等［7］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LNa通過Ras-GRF1參與調(diào)節(jié)Ras/ERK信號通路，下調(diào)細胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的含量，抑制其對細胞外基質(zhì)的降解能力，最終阻遏腫瘤細胞的黏附和遷移。研究［8］還發(fā)現(xiàn)FLNa能夠與Smads蛋白家族成員相互結(jié)合，共同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號，阻遏腫瘤細胞的遷移，相反，在不表達FLNa的腫瘤細胞中則不存在TGF-β信號。另外，酵母雙雜交實驗和細胞信號轉(zhuǎn)導通路的多項研究還證實，F(xiàn)LNa特異性地與G蛋白耦聯(lián)受體(鈣受體和多巴胺受體)、小 GTP結(jié)合蛋白(CDC42，Rac和Rho)以及其下游效應分子(SEK1)結(jié)合，共同調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，F(xiàn)LNa與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且可作為預后判斷的重要指標，但FLNa如何發(fā)揮其抑癌生物學效應還有待進一步深入研究。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2008［J］.CA Cancer J Clin，2008，58(2):71-96.

［2］Nakamura F，Osbiorn TM，Hartemink CA，et al.Structure basis of filamin A functions［J］.J Cell Biol，2007，179(5):1011-1025.

［3］史建偉，王貴英，張鴻濱，等.細絲蛋白A在結(jié)直腸腺癌中的特異性表達［J］.中國腫瘤臨床，2010，37(23):1342-1343.

［4］史建偉，于躍明，王士杰，等.細絲蛋白A抑制人結(jié)腸癌SW480細胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2011，31(9):1000-1005.

［5］史建偉，于躍明，王士杰，等.細絲蛋白A抑制荷人結(jié)腸癌細胞SW480 裸鼠移植瘤的生長［J］.腫瘤，2011，31(8):701-706.

［6］Fiori JL，Zhu TN，O'Connell MP，et al.Filamin A modulates kinase activation and intracellular trafficking of epidermal growth factor receptors in human melanoma cells［J］.Endocrinology，2009，150(6):2551-2560.

［7］Zhu TN，He HJ，Kole S，et al.Filamin A-mediated down-regulation of the exchange factor ras-GRF1 correlates with decreased matrix metalloproteinase-9 expression in human melanoma cells［J］.J Biol Chem，2007，282(20):14816-14826.

［8］Feng Y，Walsh CA.The many faces of filamin:a versatile molecular scaffold for cell motility and signalling［J］.Nat Cell Biol，2004，6(11):1034-1038.