Apelin-13對腎上腹主動脈縮窄誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

楊 攀，張 志

(1盤錦市中心醫(yī)院，遼寧盤錦124000;2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院)

心肌纖維化(MF)是多種心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，亦是心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一。MF可破壞心肌細(xì)胞間的耦聯(lián)，降低毛細(xì)血管密度，增加心肌硬度，致心臟舒張順應(yīng)性降低，是心力衰竭發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)［2］，Apelin/APJ信號系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)高度表達(dá)，在降低血壓、改善心功能、保護(hù)心肌細(xì)胞、促進(jìn)血管生成等方面有重要作用。但目前對Apelin在心力衰竭治療中的作用是否與抑制MF有關(guān)尚不清楚。2011年10月～2012年10月，我們通過腎上腹主動脈縮窄法建立大鼠心力衰竭模型，觀察外源性給予Apelin-13對大鼠MF的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量220～270(250±10)g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供;常溫低速離心機(jī)、BioRad圖像分析系統(tǒng)、倒置相差電子顯微鏡;Apelin-13(Sigma公司，美國)，大鼠Apelin-13，TGF-β1、BNP、MMP2、TIMP-1酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(RapidBio Lab，美國)，Masson 染色試劑，辣根過氧化酶標(biāo)羊抗兔IgG(天津TBD生物技術(shù)有限公司)，D-Hanks緩沖液，10%甲醛溶液。

1.2 模型制備及實(shí)驗(yàn)方案 將40只大鼠隨機(jī)分為4組各10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按文獻(xiàn)［3］中的腎上腹主動脈縮窄法建立慢性心力衰竭模型:2%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，剃毛，打開腹腔并分離腹主動脈，分離組織，用內(nèi)徑0.7 mm銀夾造成腹主動脈狹窄，分層關(guān)閉腹腔;假手術(shù)組僅分離腹主動脈未用銀夾夾閉。低劑量Apelin-13組造模同時(shí)每天予Apelin-13 1 μg/(kg·d)腹腔注射;高劑量Apelin-13組:造模同時(shí)予 Apelin-13 10 μg/(kg·d)腹腔注射;模型組和假手術(shù)組腹腔注射生理鹽水10 μg/(kg·d)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間均為4周。

1.3 各組血流動力學(xué)指標(biāo)測定 2%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉各組大鼠，經(jīng)右頸總動脈插入心導(dǎo)管，用生理儀測定大鼠左心室最大收縮壓(LVESP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)及左心室內(nèi)最大升降速度(LV±dp/dtmax)。

1.4 血清 TGF-β1、BNP、MMP2、TIMP-1 測定 各組大鼠經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管處采集血液5 mL，以3 000 r/min離心10min，吸取上清液，EP管分裝，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?yīng)用ELISA法檢測血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平。

1.5 心肌細(xì)胞膠原的定性和半定量分析 將各組大鼠開胸取出心臟，取左室中段橫截面，4%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片Masson染色，用光學(xué)顯微鏡檢測心肌細(xì)胞組織學(xué)改變。采用圖像分析系統(tǒng)，測量心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，每張心肌切片標(biāo)本隨機(jī)取4個(gè)視野測量，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，行t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

假手術(shù)組死亡1只，模型組死亡3只，低劑量Apelin-13組、高劑量 Apelin-13組均死亡2只。各組血流動力學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果見表1，血清TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1水平比較見表2。假手術(shù)組、模型組、低劑量Apelin-13組、高劑量 Apelin-13組CVF分別為(7.96±0.44)%、(18.54.±0.86)%、(16.77±0.72)%、(10.23.±0.57)%，假手術(shù)組與模型組、低劑量Apelin-13組比較，P＜0.01，與高劑量Apelin-13組比較，P＜0.05;高劑量Apelin-13組與模型組比較，P＜0.01。

3 討論

目前MF的發(fā)生機(jī)制仍未完全明確，但大量研究表明［4～6］，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活導(dǎo)致的心肌重構(gòu)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)與組織抑制因子(TIMP)平衡失調(diào)導(dǎo)致的膠原合成代謝和降解代謝失衡是MF發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。另一方面，臨床工作者們發(fā)現(xiàn)，ACEI及ARB類神經(jīng)拮抗劑藥物雖然對抑制心肌重構(gòu)有一定效果，但對MF的效果并不理想，此提示除腎素—血管緊張素(RAS)系統(tǒng)外可能有其他神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)參與MF的形成與發(fā)展［7］。

表1 各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

表1 各組血流動力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01

組別 n LVESP(mmHg) LVEDP(mmHg) LV+dp/dtmax(mmHg/s) LV-dp/dtmax(mmHg/s)模型組 7 79±12* 18.8±4.2* 1 543±148* 1 637±146*低劑量Apelin-13組 8 82±9* 16.9±3.8* 1 702±224* 1 698±221*高劑量Apelin-13組 8 98±14＊△ 9.4±2.4＊△ 2 188±206＊△ 2 078±212＊△假手術(shù)組9 114±12 3.9±1.1 3 018±241 2 827±214

表2 各組血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平比較(±s)

表2 各組血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與低劑量 Apelin-13組比較，#P ＜0.05

組別 n TGF-β1(pg/mL) BNP(pg/mL) MMP-2(μg/L) TIMP-1(μg/L)MMP-2/TIMP-1模型組 10 67.89±3.27＊＊# 42.04±6.62＊＊# 11.78±1.32＊＊# 23.47±2.37＊＊# 0.50±0.06＊＊#低劑量Apelin-13組 10 58.78±2.15＊＊△ 38.76±4.31＊＊△ 13.70±2.14＊＊ 21.15±2.21＊＊△ 0.64±0.05＊＊△高劑量Apelin-13組 10 52.58±2.13△△# 30.28±4.42△△# 20.62±1.19△△# 16.81±1.31△△# 1.23±0.03△△#假手術(shù)組 10 45.36±2.08 24.35±2.36 24.31±1.13 12.63±1.08 1.92±0.05

Apelin/APJ信號系統(tǒng)是近年來新發(fā)現(xiàn)的信號系統(tǒng)，與RAS系統(tǒng)相似，Apelin/APJ信號系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)高度表達(dá)，而其生理作用卻截然相反。研究表明［8］，在心力衰竭代償期內(nèi)機(jī)體內(nèi)源性Apelin表達(dá)增加，而在心力衰竭晚期其表達(dá)水平則降低。Japp等［9］研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予Apelin能有效改善各種缺血性及非缺血性心臟病的心功能而不引起心肌肥厚。Apelin在心血管疾病的治療和預(yù)防中可能有更廣闊的前景。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用腎上腹主動脈縮窄法誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠血流動力學(xué)發(fā)生異常改變，左室肌纖維排列紊亂，可見大量膠原纖維變性，血管周圍亦可見反應(yīng)性纖維化，CVF異常升高。而較大劑量腹腔注射外源性Apelin-13，大鼠血流動力學(xué)得到明顯改善，CVF有所降低，提示Apelin-13可減輕心肌損傷，有效阻止心肌纖維化。

近年來對Apelin的心臟保護(hù)作用機(jī)制研究日益增多，Apelin可能通過多種細(xì)胞因子和神經(jīng)內(nèi)分泌因子參與調(diào)節(jié)MF的形成和發(fā)展。TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，具有細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，其可抑制實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成［10］。目前，TGF-β1 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，促進(jìn)纖維化的作用已得到多數(shù)學(xué)者認(rèn)同，關(guān)于TGF-β1促進(jìn)肺纖維化、腎臟纖維化、MF 等均有報(bào)道［11～13］。BNP 是近年來研究較多的一種神經(jīng)內(nèi)分泌因子，主要由心肌細(xì)胞分泌，當(dāng)心室負(fù)荷加重時(shí)，BNP生成增加。研究證實(shí)BNP與心肌重構(gòu)密切相關(guān)［14］。MMPs能降解細(xì)胞外基質(zhì)，是心肌間質(zhì)重建中基質(zhì)降解的重要因素，而TIMPs是MMPs內(nèi)源性特異性抑制劑。其中TIMP-1與MMP-2關(guān)系密切，且在心臟表達(dá)較多。本研究結(jié)果表明在大鼠心力衰竭模型中TGF-β1、BNP明顯升高，證實(shí)TGF-β1參與MF的發(fā)生與發(fā)展，此與大部分學(xué)者的研究結(jié)果一致，而BNP異常升高表明MF大鼠中存在神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)異常。外源性給予Apelin-13后TGF-β1、BNP水平明顯降低，MMP-2明顯升高，TIMP-1明顯降低，MMP-2/TIMP-1接近正常。表明Apelin-13可能通過調(diào)節(jié)MMP-2/TIMP-1，抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成，促進(jìn)心肌細(xì)胞外基質(zhì)成分降解，抑制心肌重構(gòu)及MF。

綜上所述，外源性給予Apelin-13可改善大鼠血流動力學(xué)，有效抑制 TGF-β1、BNP，調(diào)節(jié) MMP-2/TIMP-1平衡，抑制MF，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。此對于防治心力衰竭、降低血管疾病的死亡率有重要意義，亦對Apelin-13治療心臟疾病提供了新的依據(jù)。

［1］陳蓉，謝梅林.TGF-β/Smads信號通路在心肌纖維化發(fā)生和治療中應(yīng)用前景的研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(9):1189-1192.

［2］李麗英，魏雪梅，王偉，等.Apelin-APJ系統(tǒng)研究新進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，40(22):2275-2278.

［3］Anversa P，Hagopian M，Loud AV.Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiacInest hypertrophy［J］.Lab Inest，1973，29(3):282-292.

［4］謝亞芹，劉宏偉，李秀芬，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1和結(jié)締組織生長因子在慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化中的動態(tài)表達(dá)［J］.解剖學(xué)雜志，2011，34(4):446-449.

［5］趙凌杰，焦東東，趙智明，等.卡托普利對腹主動脈縮窄大鼠模型心?、窈廷笮湍z原及其mRNA表達(dá)的影響［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，35(11):1081-1084.

［6］陳蓉，謝梅林.葛根素對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化的防治作用及機(jī)制探討［J］.山東醫(yī)藥，2012，52(15):20-22.

［7］Creemers EE，Pinto YM.Molecular mechanisms that control interstitial fibrosis in the pressure-overloaded heart［J］.Cardiovasc Res，2011，89(2):265-272.

［8］陳曦，趙永芳.丹參酮ⅡA對異丙腎上腺素致心肌缺血損傷大鼠apelin及其受體的影響［J］.中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2012，9(1):18-21.

［9］Japp AG，Newby DE.The apelin-APJ system in heart failure:pathophysiologic relevance and therapeutic potential［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(10):1882-1892.

［10］馬麗娟，杜國利，呂文魁，等.氯沙坦鉀對2型糖尿病腎病大鼠腎臟TGF-β1、CD68和MCP-1表達(dá)的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(5):947-950.

［11］官鍵，劉來昱，李啟生，等.TGF-β在放射性肺損傷大鼠肺組織中的表達(dá)及意義［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41(10):964-965.

［12］孫珉丹，陳志，馮野，等.TGF-β1基因多態(tài)性與IgA腎病病理改變間的關(guān)系［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011，15(12):2122-2123.

［13］劉秀芳，王炳勝，李鳳玉，等.益氣活血中藥對放射損傷大鼠肺組織TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18(8):1477-1480.

［14］毛福青，吳明星，何穩(wěn)，等.N末端B型腦鈉肽前體在心力衰竭中的診斷和預(yù)后價(jià)值［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究，2010，27(2):305-307.