HHEX基因rs1111875G/A多態(tài)性與妊娠糖尿病的關(guān)系

何明明，班 博，張 梅，李 萍，孫海玲，潘耀平，王艷萍

(1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070;2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

妊娠糖尿病 是指妊娠過(guò)程中發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的任何程度的糖耐量異常，其發(fā)病機(jī)制涉及胰島素分泌缺陷及胰島素抵抗。目前認(rèn)為其與2型糖尿病(T2DM)相似，亦是遺傳基因和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。T2DM家族史增加了妊娠婦女發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)［1］，GDM婦女產(chǎn)后發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)亦顯著升高(RR=7.43)［2］，此均提示 GDM 和T2DM有相同的遺傳發(fā)病基礎(chǔ)。已有研究證實(shí)2007年GWAS發(fā)現(xiàn)的部分T2DM易感基因與GDM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［3，4］，但造血干細(xì)胞表達(dá)同源盒(HHEX)基因rs1111875與中國(guó)人群GDM發(fā)病的相關(guān)性尚不明確。2010年10月～2012年3月，我們采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCRRFLP)方法對(duì)451例妊娠婦女HHEX基因rs1111875的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行了檢測(cè)，旨在探討其與GDM的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制。(GDM)

1 資料與方法

1.1 臨床資料 24～28周妊娠期婦女451例，年齡22～43歲。行75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)并留取空腹、糖負(fù)荷后1 h及2 h血糖，同時(shí)采集身高、孕前體質(zhì)量、血壓［收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)］，并計(jì)算孕前 BMI=體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。采用胰島β細(xì)胞分泌功能指數(shù)(HOMA-B)和穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)評(píng)估胰島β細(xì)胞功能及胰島素抵抗，計(jì)算方法:HOMA-B=20×空腹胰島素(FINS)/(FPG-3.5)，HOMA-IR=FPG×FNS/22.5。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清FINS，在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血脂。采用2011年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)(ADA)診斷標(biāo)準(zhǔn)［空腹血糖(FPG)≥5.1 mmol/L，糖負(fù)荷后1 h PG≥10.0 mmol/L，糖負(fù)荷后2 h≥8.5 mmol/L，其中1項(xiàng)符合者將被診斷為GDM］［5］。符合診斷標(biāo)準(zhǔn)者(203例)納入GDM組，不符合者(248例)納入糖耐量正常(NGT)組，個(gè)體間均無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn):其他類型糖尿病及其合并妊娠者;肝腎功能不全(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶＞正常上限的2倍，血肌酐＞正常上限的1.2倍)及合并慢性炎性疾病者。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 HHEX基因rs1111875G/A多態(tài)性檢測(cè)方法受試者禁食8～10 h以上，抽取肘靜脈血1 mL抗凝，存放于-20℃冰箱用于提取全血基因組。采用血液基因組提取試劑盒(0.1～1.0 mL)提取DNA(北京天根生化科技有限公司)。引物應(yīng)用Primer Premer5.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，DL1000 DNA Marker由大連寶生物工程有限公司提供。上游引物序列為5'-AAC ATC TAA ACA AGG GGC AG-3'，下游引物序列為5'-TTT TCC CTT TCA GAC TTG GC-3'。PCR 反應(yīng)體系為50 μL:PCR Master Mix(2×)25 μL;上游及下游引物(濃度100 μmol/L)各 0.2 μL;模板 DNA 3 μL;ddH2O(nuclease-free)21.8 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min，95 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系20 μL:10×NEB-uffer4緩沖液2 μL;PCR 產(chǎn)物 10 μL;100×BSA 為0.2 μL;XbaI 0.5 μL;滅菌雙蒸水 7.5 μL。內(nèi)切酶(XbaI)由北京NEB公司提供。條件:恒溫水浴鍋37℃水浴5 h。用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)觀測(cè)結(jié)果。選取部分PCR產(chǎn)物至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。以Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)各組基因的平衡代表性。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，非正態(tài)分布資料經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布資料后進(jìn)行分析。組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD法。各組間基因型分布及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，Logistic回歸分析基因與疾病的相關(guān)性，并以優(yōu)勢(shì)比(OR)表示。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增、酶切及測(cè)序結(jié)果 HHEX基因rs1111875位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為長(zhǎng)583 bp的片段(見圖1)。應(yīng)用XbaI進(jìn)行酶切，因攜帶G等位基因的目的片段不含XbaI的酶切位點(diǎn)，所以GG基因型酶切后顯示一條片段:583 bp，GA基因型顯示三條片段:583 bp、400 bp、183 bp，AA 基因型顯示兩條片段:400 bp和 183 bp(見圖2)。測(cè)序結(jié)果證實(shí)HHEXrs1111875位點(diǎn)有GG、GA、AA三種基因型，且酶切結(jié)果符合率為100%。

圖1 rs1111875 PCR產(chǎn)物

圖2 rs13266634多態(tài)性酶切結(jié)果

2.2 HHEX基因rs1111875單核苷酸多態(tài)性分析rs1111875基因型頻率在GDM組和NGT組均符Hardy-Weinberg平衡(P均＞0.05)，提示本研究人群能代表群體分布情況。GDM組GG、GA、AA基因型頻率分別為9.9%、42.4%、47.8%，NGT組分別為4.0%、40.7%、55.2%，兩組比較，P均 ＜0.05。GDM組G、A等位基因頻率分別為31.0%、69.0%，NGT組分別為24.4%、75.6%，兩組比較，P＜0.05。G等位基因攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是A等位基因的1.40倍(OR=1.395，95%CI為1.040～1.871，P=0.026)。

2.3 HHEX基因rs1111875三種基因型間臨床資料及生化指標(biāo)比較 GG、GA和AA基因型之間，年齡、孕前 BMI、DBP、FPG、2 h PG、TG、TCH 、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、HOMA-IR的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，其余生化指標(biāo)比較見表1。

表1 各基因型間生化指標(biāo)比較(±s)

表1 各基因型間生化指標(biāo)比較(±s)

注:與GG基因型比較，*P＜0.01;與GA基因型比較，△P＜0.05;FINS、HOMA-B均經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換

基因型 n 1 h PG(mmol/L)FINS(mU/L) HOMA-B SBP(mmHg)GG 30 9.7±2.7 2.37±0.30 5.02±0.64 123±13 GA 187 8.9±2.7 2.52±0.27 5.33±0.62 119±11 AA 234 8.3±2.7* 2.52±0.26* 5.37±0.55* 122±12△

2.4 Logistic回歸分析GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素 以是否發(fā)生GDM為因變量，以年齡、孕前BMI、舒張壓、rs1111875基因型為自變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示GA基因型患GDM的危險(xiǎn)度增加，為AA基因型的1.32倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.320，95%CI為0.838～2.077，P=0.231)，GG基因型者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是AA基因型的4.1倍(OR=4.129，95%CI為 1.589～ 10.731，P=0.004)，且獨(dú)立于年齡、孕前 BMI、舒張壓;年齡增大、孕前BMI升高和DBP升高均為GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素(OR=1.062～1.387，P 均 ＜0.01)，見表2。

表2 Logistic回歸分析GDM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素

3 討論

HHEX基因位于人類10號(hào)染色體q23.33長(zhǎng)270kb的連鎖不平衡區(qū)，該區(qū)域包括三個(gè)基因:胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)基因，驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員 11(kinesin family member 11，KIF11)基因和 HHEX基因。2007年Slake等［6］發(fā)現(xiàn)HHEX-KIF11-IDE區(qū)與T2DM有關(guān)的基因變異位于HHEX基因的3'端，其中包括rs1111875位點(diǎn)G/A單核苷酸多態(tài)性。隨后，多項(xiàng)研究證實(shí)了HHEX基因rs1111875G/A多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性［7～9］，Cho等［3］和 Lauenborg 等［4］還報(bào)道了 HHEX 基因rs1111875單核苷酸多態(tài)性與GDM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)。

本研究顯示HHEX基因rs1111875基因型頻率分布在GDM組和NGT組明顯不同，這提示HHEX基因rs1111875的三種基因型(GG、GA、AA)與山東濟(jì)寧地區(qū)GDM的發(fā)生有關(guān)。GDM組中G等位基因、GG基因型頻率均顯著高于NGT組，G等位基因攜帶者發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)是非攜帶者的1.40倍(OR=1.395，95%CI為1.040～1.871，P=0.026)，提示G等位基因可能是GDM的風(fēng)險(xiǎn)等位基因，HHEX基因rs1111875G/A多態(tài)性可能與山東濟(jì)寧地區(qū)GDM有關(guān)，此與韓國(guó)［3］和丹麥［4］報(bào)道的結(jié)果相一致。本研究GDM組中GG基因型頻率與韓國(guó)人群相似［3］(9.9% vs 11.8%)，但 明 顯 低 于 丹 麥 人 群［4］(37.6%)，推測(cè)基因型頻率的不同可能與種族差異及樣本量大小有關(guān)。Logistic回歸分析顯示GG基因型為GDM的危險(xiǎn)因素，GG基因型攜帶者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)是 AA型的 4.1倍(OR=4.129，95%CI為1.589～10.731，P=0.004)，且獨(dú)立于年齡、孕前BMI和DBP，這提示攜帶GG基因型者患GDM的風(fēng)險(xiǎn)將大大增加。

GG基因型與AA基因型相比，1 h PG顯著升高(P＜0.01)，而FINS和HOMA-B顯著降低(P均＜0.01)，這提示HHEX基因rs1111875的G等位基因使山東濟(jì)寧地區(qū)GDM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高可能是通過(guò)減少胰島素分泌實(shí)現(xiàn)的。HHEX基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá)于胚胎和成熟的胰腺中，并參與Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能［10，11］。研究表明敲除該基因后，內(nèi)胚層上皮細(xì)胞增殖受損，最終影響胰腺胚芽的發(fā)生與形態(tài)［10］。因該部分胰腺是胰多肽產(chǎn)生的部位，因此HHEX單核苷酸多態(tài)性可能影響胚胎期或成年期激素的產(chǎn)生，并影響胰島素的釋放。據(jù)此推測(cè)攜帶GG基因型可能使胰島β細(xì)胞功能受損，胰島素分泌減低，進(jìn)而引起血糖升高。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)HHEX基因rs1111875G/A多態(tài)性與GDM患者胰島素抵抗存在相關(guān)性。

綜上所述，HHEX基因rs1111875G/A多態(tài)性與山東濟(jì)寧地區(qū)GDM的發(fā)生有關(guān)，G等位基因可能是其風(fēng)險(xiǎn)等位基因，GG基因型可能與GDM患者胰島素分泌量減低有關(guān)，但其具體機(jī)制尚不明確。因此，仍需進(jìn)一步深入研究HHEX基因rs1111875G/A多態(tài)性與GDM發(fā)病相關(guān)的作用機(jī)制。

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