尿素包合法富集純化杜仲籽油α－亞麻酸的工藝優(yōu)化

孫蘭萍，許 暉，馬 龍，趙大慶

(1.蚌埠學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與環(huán)境工程系，安徽蚌埠233000;2.蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233000)

杜仲是我國(guó)特有的木本植物和經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種。杜仲籽是杜仲種植業(yè)的副產(chǎn)品，我國(guó)現(xiàn)有杜仲種植面積超過(guò)30余萬(wàn)公頃，杜仲籽資源十分豐富。杜仲籽的含油量一般在27%～33%，杜仲籽油中富含多不飽和脂肪酸，其中α－亞麻酸更是達(dá)61%～63%［1］，是迄今發(fā)現(xiàn)的一種與蘇籽油成分相仿的，高α－亞麻酸含量的天然植物油。在國(guó)外α－亞麻酸含量較多的亞麻籽油和紫蘇籽油已進(jìn)入保健食品市場(chǎng)。德國(guó)、美國(guó)、日本等國(guó)也將α－亞麻酸及其衍生物作為藥物或食品添加劑，用來(lái)預(yù)防和治療高血壓、高血脂、癌癥等多種疾病。綜上所述，從杜仲籽中提取杜仲籽油，再對(duì)其中的α－亞麻酸進(jìn)行純化富集，對(duì)杜仲深加工及杜仲資源綜合開(kāi)發(fā)利用具有重大意義。α－亞麻酸的富集純化方法主要有低溫結(jié)晶法、尿素包合法、分子蒸餾法、銀離子絡(luò)合法、柱色譜法、吸附分離法、超臨界流體精餾法等［2］。其中，尿素包合法工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，包合過(guò)程在低溫和惰性氣氛下進(jìn)行，確保了α－亞麻酸的生理活性。本實(shí)驗(yàn)以尿素包合法富集純化杜仲籽油α－亞麻酸，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，分析建立α－亞麻酸純度的二次多元回歸方程預(yù)測(cè)模型，以期為高含量α－亞麻酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)中各變量的編碼及因素水平Table 1 Codes and actual levels of independent variables in quadratic rotation－orthogonal combination design

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲籽油(α－亞麻酸含量58.86%)五臺(tái)縣五臺(tái)山沙棘制品有限公司(超臨界CO2萃取獲得);α－亞麻酸甲酯對(duì)照品 Sigma公司;NaOH、KOH、石油醚(30～60℃)、正己烷、尿素、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、95%乙醇、濃鹽酸、NaCl、無(wú)水硫酸鈉 均為分析純。

SP－6800A氣相色譜儀 山東魯南瑞虹化工儀器有限公司;UV1102紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 蘇州江東精密儀器有限公司;SHB－ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 河南太康科教器材廠;FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DZF－6051型真空干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;DK－98－1型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;冰箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 杜仲籽油混合脂肪酸的制備［3－8］稱取一定量的杜仲籽油，按1∶6(V/V)比例加入1.0mol/L的NaOH－乙醇溶液，置于500mL三口燒瓶中，在60℃的水浴中加熱回流(N2保護(hù))，磁力攪拌1h，得皂化液，加入少量石油醚萃取除去不皂化物，冷卻至室溫后置于冰箱中，使皂析出，過(guò)濾得皂化物，加入適量水使生成的少量皂完全溶解，用6.0mol/L的HC1溶液酸化混合液至 pH2～3，加入石油醚，充分?jǐn)嚢?，靜置分層，分取上層石油醚相，水層加石油醚萃取3次，合并有機(jī)相。有機(jī)相以5%NaCl水溶液水洗至中性，加入無(wú)水硫酸鈉脫水，抽濾，旋蒸，回收石油醚，得到杜仲籽油混合脂肪酸。

1.2.2 α－亞麻酸含量的檢測(cè)方法——?dú)庀嗌V分析法［4，9－12］采用氣相色譜法測(cè)定樣品中的脂肪酸組成，以峰面積歸一化法計(jì)算α－亞麻酸的純度。

1.2.2.1 氣相色譜條件 HP－WAX柱(30m×0.25mm，0.5μm);載氣為高純氮?dú)?，氮?dú)饬魉?5mL/min;檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，氫氣流速30mL/min，空氣流速 300mL/min;柱溫:起始溫度200℃，恒溫2min，以15℃/min程序升溫至260℃，保持5min;進(jìn)樣器溫度為260℃;檢測(cè)器溫度為260℃;分流比為 50∶1;進(jìn)樣量 1.0μL。

1.2.2.2 杜仲籽油甲酯化 稱取約0.2g杜仲籽油置于25mL具塞試管中，加入2mL石油醚－苯(V∶V=1∶1)溶解，再加入0.2 mol/L KOH－甲醇溶液 5mL，于50℃水浴中震蕩反應(yīng)30min，冷卻，加入2mL飽和NaCl溶液，混勻后靜置10min分層，取上清液，加入少量無(wú)水硫酸鈉，離心，取上清液。

1.2.2.3 混合脂肪酸甲酯化 取混合脂肪酸樣品0.2g，置于25mL具塞試管中，加入0.2mol/L KOH－甲醇溶液5mL，于50℃水浴中震蕩反應(yīng)30min，冷卻，加入石油醚5mL、飽和 NaCl溶液2mL，震蕩10min，靜置分層，取上清液，加入無(wú)水硫酸鈉少許，離心，取上清液。

1.2.3 杜仲籽油 α－ 亞麻酸尿素包合方法［4－6，8，13－15］按實(shí)驗(yàn)方案預(yù)先設(shè)定的比例，將一定量的尿素和95%乙醇加入到500mL三口燒瓶中，于60℃水浴中磁力攪拌并加熱回流，至尿素溶解完全后，加入一定量的已在60℃水浴中預(yù)熱過(guò)的杜仲籽油混合脂肪酸(N2保護(hù))，反應(yīng)混合物于60℃加熱回流并磁力攪拌至變成澄清透明溶液后，于室溫下冷卻30 min，后在預(yù)先設(shè)定的溫度下進(jìn)行包合反應(yīng)。包合一定的時(shí)間后取出迅速減壓抽濾，用95%的乙醇清洗結(jié)晶體，濾液移入分液漏斗，加入適量石油醚，用10%的HC1溶液酸化濾液至pH2～3，再加入適量水，充分萃取，分取有機(jī)相，用石油醚多次萃取水相，棄去水層，合并有機(jī)相，有機(jī)相以5%NaCl水溶液水洗至中性，加入少量無(wú)水硫酸鈉脫水，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到富集的不飽和脂肪酸。

1.2.4 杜仲籽油α－亞麻酸尿素包合工藝的優(yōu)化根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，分別選取尿素與脂肪酸質(zhì)量比、95%乙醇與脂肪酸質(zhì)量比、包合溫度以及包合時(shí)間為4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，以α－亞麻酸純度為考察指標(biāo)，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)4因素4水平的二次正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化確定最佳尿素包合工藝參數(shù)。確定尿素與脂肪酸質(zhì)量比(X1)、95%乙醇與脂肪酸質(zhì)量比(X2)、包合溫度(X3)以及包合時(shí)間(X4)的零水平分別為 3∶1、8∶1、0℃ 和 16h。二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)中各變量的編碼和相應(yīng)的因素水平值見(jiàn)表1。采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

2.2 回歸模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，計(jì)算出回歸模型方程的各項(xiàng)系數(shù)，從而得到α－亞麻酸純度(Y)的回歸模型方程如下:

表2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Quadratic rotation－orthogonal combination experimental design scheme and results

為檢驗(yàn)回歸模型方程(1)的有效性，按F1=失擬均方/誤差均方，F(xiàn)2=回歸均方/剩余均方，進(jìn)行二次F檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析如表3所示。

由表3可知，回歸模型方程的失擬性檢驗(yàn)F1=2.57135 ＜F0.05(10，11)=2.85 及 F0.01(10，11)=4.54，失擬不顯著，說(shuō)明所建立的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)模Ｐ头匠膛c實(shí)際情況擬合較好;回歸方程顯著性檢驗(yàn)F2=25.02630＞F0.01(14，21)=3.07及 F0.05(14，21)=2.20，檢驗(yàn)極顯著，說(shuō)明該模型方程與實(shí)際情況吻合很好，模型成立。對(duì)回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，得到簡(jiǎn)化后的回歸模型方程為:

2.3 回歸模型方程的解析

2.3.1 單因素效應(yīng)分析 采用降維分析法，將回歸得到的簡(jiǎn)化模型方程(2)的四個(gè)因素中任意三個(gè)固定在零水平，對(duì)單因素進(jìn)行效應(yīng)分析，結(jié)果見(jiàn)表4及圖1。

表4 單因素效應(yīng)分析Table 4 Effective analysis of single factor

圖1 各單因素與α－亞麻酸純度(%)關(guān)系曲線Fig.1 The relationship curves of single factors to the purity of α－linolenic acid(%)

由表4及圖1可知，尿素與脂肪酸的質(zhì)量比(X1)、95%乙醇與脂肪酸的質(zhì)量比(X2)以及包合時(shí)間(X4)3個(gè)影響因素在－2到2水平上變化時(shí)，α－亞麻酸純度首先隨著因素水平值的增加而增加，至最大值后，又隨著因素水平值的進(jìn)一步增加而有所減小;而包合溫度(X3)影響因素在－2到－1水平上時(shí)，隨著因素水平值的增加，α－亞麻酸純度呈小幅度緩慢上升，包合溫度變化對(duì)α－亞麻酸純度的影響不太明顯，在－1到2水平上時(shí)，隨著包合溫度因素水平值的增加，α－亞麻酸純度則明顯下降。上述各單因素變化趨勢(shì)與前期單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本吻合。

此外，由圖1可知，在處于－2～2水平區(qū)間時(shí)，各影響因素 X1、X2、X3、X4與 α－亞麻酸純度關(guān)系曲線中，包合溫度(X3)與α－亞麻酸純度的關(guān)系曲線最接近線性關(guān)系，表明包合溫度(X3)對(duì)α－亞麻酸純度的影響最為顯著，與由表3中F值導(dǎo)出的結(jié)論一致。由表3中F值大小可知，各影響因素 X1、X2、X3、X4對(duì)α－亞麻酸純度影響的主次順序依次為:包合溫度(X3)＞95%乙醇與脂肪酸的質(zhì)量比(X2)＞尿素與脂肪酸的質(zhì)量比(X1)＞包合時(shí)間(X4)。

表3 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis for the experimental results of quadratic rotation－orthogonal combination design

表5 各變量Xi取值頻率分布Table 5 Probability distribution of each variable Xi

2.3.2 各因素之間的兩兩交互作用效應(yīng)分析 將回歸得到的簡(jiǎn)化模型方程(2)的四個(gè)因素中任意兩個(gè)固定在零水平，考察四個(gè)因素中兩兩間的交互作用，可分別做出其相應(yīng)的響應(yīng)面圖。

觀察各相應(yīng)面圖并結(jié)合表 3中 X1X2，X1X3，X1X4，X2X3，X2X4，X3X4各項(xiàng) p 值的大小可知，回歸得到的模型方程(1)中，具有顯著性(p＜0.05)的交互作用項(xiàng)僅有X1X3，見(jiàn)圖2。由圖2可知，在尿素與脂肪酸的質(zhì)量比(X1)一定時(shí)，隨著包合溫度(X3)的逐漸升高，α－亞麻酸純度先短暫小幅度緩慢上升后即大幅度明顯下降，表明包合溫度的改變對(duì)α－亞麻酸純度的影響顯著，隨著包合溫度的升高，α－亞麻酸純度整體上呈下降趨勢(shì)。而在一定包合溫度下，隨著尿素與脂肪酸質(zhì)量比的增加，α－亞麻酸的純度也相應(yīng)增加，但α－亞麻酸的純度增至最大值后，隨著尿素與脂肪酸質(zhì)量比的進(jìn)一步增大，α－亞麻酸的純度則反而有所下降。當(dāng)尿素與脂肪酸的質(zhì)量比(X1)位于－1.5～1.5 水平，包合溫度(X3)位于－2～－0.5 水平時(shí)，α－亞麻酸的純度相對(duì)較高。

2.4 包合工藝參數(shù)的優(yōu)化

為了獲得最佳包合工藝參數(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)分析。選取α－亞麻酸純度大于78.01%的139個(gè)方案進(jìn)行頻數(shù)分析，得到95%的置信區(qū)間如表5所示。

圖2 尿素與脂肪酸的質(zhì)量比(X1)與包合溫度(X3)的交互作用Fig.2 The interaction of urea－fatty acid ratio(X1)and inclusion temperature(X3)

由表5可知，尿素包合法富集純化α－亞麻酸的最佳包合工藝參數(shù)范圍分別為:尿素與脂肪酸質(zhì)量比為2.936∶1～3.143∶1，95% 乙醇與脂肪酸質(zhì)量比為9.118∶1～9.76∶1，包合溫度為－10.75～－7.81℃，包合時(shí)間為16.656～17.816h。在此包合參數(shù)范圍內(nèi)，富集純化獲得的α－亞麻酸的純度均大于78.01%?？紤]到生產(chǎn)實(shí)際的可操作性，可將最佳包合工藝條件定為:尿素與脂肪酸質(zhì)量比為3∶1，95%乙醇與脂肪酸質(zhì)量比為9∶1，包合溫度為－9.0℃，包合時(shí)間為17.0h。

2.5 回歸模型方程的驗(yàn)證

為檢驗(yàn)二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)分析得到的回歸模型方程的可靠性，選取優(yōu)化獲得的最佳包合工藝參數(shù)進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并在對(duì)應(yīng)條件下用回歸方程(2)求出α－亞麻酸純度的理論預(yù)測(cè)值，與實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值比較。結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值相比，其平均絕對(duì)誤差僅為－0.98%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)回歸得到的模型方程是可靠的，其擬合結(jié)果具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of validation expertments

3 結(jié)論

3.1 杜仲籽油富含α－亞麻酸，是α－亞麻酸的理想來(lái)源。本研究首次嘗試?yán)枚胖僮延蜕a(chǎn)高α－亞麻酸含量的產(chǎn)品，為α－亞麻酸保健品的生產(chǎn)及杜仲籽的深加工及綜合利用提供了新的途徑。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尿素包合法富集純化杜仲籽油α－亞麻酸的最佳工藝條件是:尿素與脂肪酸質(zhì)量比為3∶1，95%乙醇與脂肪酸質(zhì)量比為9∶1，包合溫度為－9.0℃，包合時(shí)間為17.0h。最佳包合工藝條件下，α－亞麻酸的純度可達(dá) 82.63%，與理論預(yù)測(cè)值83.61%相比僅相差－0.98%。

3.3 本純化富集工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，且所用試劑價(jià)廉易得，均可回收再利用，較適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，但若要進(jìn)一步提高α－亞麻酸純度，獲得高純度的α－亞麻酸，生產(chǎn)中還需將不同純化方法進(jìn)行組合優(yōu)化。

［1］麻成金.杜仲籽油的提取及微膠囊化技術(shù)研究［M］.長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［2］孫蘭萍，張少君，馬龍，等.α－亞麻酸的分離與純化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.包裝與食品機(jī)械，2010，29(2):51－55.

［3］吳彩娥，許克勇，李元瑞，等.尿素包合法富集獼猴桃籽油中 α－亞麻酸［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2005，36(5):57－60，64.

［4］趙虹橋.枳椇籽油α－亞麻酸的提取、富集及微膠囊化技術(shù)研究［M］.長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［5］呂秋楠.蠶蛹中高純度α－亞麻酸及氨基酸提取工藝的研究［M］.蘭州:蘭州理工大學(xué)，2009.

［6］楊秀芳，伍發(fā)云，杜小暉.尿素包合法富集花椒籽油中α－亞麻酸工藝的研究［J］.陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，27(5):65－67.

［7］吳明一.尿素包合法純化不飽和脂肪酸的研究［M］.天津:天津大學(xué)，2007.

［8］張氽，闞建全，陳宗道.尿素包合法分離花椒籽油中的α－亞麻酸的正交實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)食品添加劑，2004，2:28－31.

［9］蘆雅麗，趙建邦，宋平順.氣相色譜法測(cè)定白蘇子與紫蘇子中亞油酸和－亞麻酸的含量［J］.中國(guó)藥師，2010，13(8):1087－1089.

［10］彭密軍，彭勝，伍鋼，等.杜仲籽油中α－亞麻酸的甲酯化方法優(yōu)化［J］.中國(guó)油脂，2009，34(1):76－79.

［11］岳巧云，張靜，劉恭源，等.氣相色譜法測(cè)定干果中的α－亞麻酸［J］.食品科學(xué)，2009，30(24):359－361.

［12］李大婧，宋江峰，鄭安儉，等.氣相色譜法測(cè)定軟膠囊中α－亞麻酸的含量［J］.江蘇農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007，23(5):497－498.

［13］趙人俊，鄭幼霞.月見(jiàn)草中 r－亞麻酸富集研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，1995，10(2):44－47.

［14］張海祥，方婷婷，潘文娟，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化尿素包合富集蠶蛹油 α－亞麻酸的工藝［J］.食品科學(xué)，2011，32(4):74－77.

［15］胡小泓，潘成杰，王超，等.葵花油不飽和脂肪酸的富集工藝研究［J］.西部糧油科技，2001，26(2):16－17.