內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因G894T多態(tài)性與老年鈣化性心瓣膜病的關(guān)系

侯冰心,胡 松,程永紅,張美紅,毛擁軍

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院特需保健科,青島 266003）

老年鈣化性心瓣膜病（senile calcific valve disease，SCVD）又稱老年退行性心瓣膜?。╯enile degenerated heart valvular disease，SDHVD），是一種與年齡相關(guān)、以瓣膜鈣化為主要特點(diǎn)的心瓣膜疾病，主要累及主動(dòng)脈瓣和二尖瓣，尤以主動(dòng)脈瓣的主動(dòng)脈面病變較多、程度較重，是引起老年人心律失常、心力衰竭、甚至猝死的原因之一[1,2]。有研究顯示，SCVD的發(fā)生有家族聚集性及遺傳傾向[3]。既往研究顯示，載脂蛋白E基因、維生素D受體基因等與SCVD的發(fā)生有關(guān)[4,5]。近年來發(fā)現(xiàn)，在主動(dòng)脈瓣表面有內(nèi)皮細(xì)胞表型，與主動(dòng)脈瓣心室面相比，主動(dòng)脈面的內(nèi)皮細(xì)胞表型較多，且其分布程度與鈣化嚴(yán)重程度成正相關(guān)[6]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide syntheses，eNOS）由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，對(duì)心血管疾病發(fā)生有重要作用[7]。本研究利用基因芯片技術(shù)及病例對(duì)照研究流行病學(xué)方法，探討eNOS G894T多態(tài)性與SCVD的相關(guān)性，為其病因?qū)W研究、防治提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2010年至2011年青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院特需保健科就診患者，經(jīng)心臟超聲檢查確診為瓣膜退行性變65歲以上的SCVD患者132例，其中男77例，女55例，年齡范圍65～92（79.2±6.3）歲；選擇無瓣膜鈣化65歲以上的患者 108例作為對(duì)照，其中男52例，女56例，年齡范圍65～90（78.0±6.1）歲。

排除標(biāo)準(zhǔn)：風(fēng)濕性心瓣膜病，先天性心瓣膜疾病，感染性心瓣膜疾病，嚴(yán)重心、腦、腎疾病，多臟器功能衰竭，甲狀腺、甲狀旁腺疾病，骨質(zhì)疏松，慢性腎功能不全，惡性腫瘤以及其他影響鈣磷代謝的疾病和藥物作用。

1.2 方法

1.2.1 病史采集、體格檢查及生化指標(biāo)測(cè)量 就診當(dāng)日進(jìn)行既往病史、吸煙史、用藥史等詢問。對(duì)身高、體質(zhì)量、血壓等進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。

次日清晨于安靜狀態(tài)下取平臥位抽取空腹血，應(yīng)用日立7600-210全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

1.2.2 心臟超聲檢查 全部病例由 GE Vivid7彩色多普勒心臟超聲儀（美國(guó)GE公司）進(jìn)行心臟超聲檢查。探頭頻率為3.5MHz。患者取左側(cè)臥位或仰臥位，行胸骨旁左室長(zhǎng)軸、心尖四腔、心尖五腔、胸骨旁短軸等常規(guī)切面進(jìn)行探測(cè)。觀察各心腔大小、室壁厚度、活動(dòng)度、收縮及舒張功能，瓣膜形態(tài)、厚度、回聲強(qiáng)弱、運(yùn)動(dòng)情況，并運(yùn)用彩色、脈沖或連續(xù)多普勒測(cè)量各瓣口血流流速及壓差。有瓣膜狹窄者用描記法測(cè)量瓣口面積。

超聲心動(dòng)圖診斷瓣膜鈣化的標(biāo)準(zhǔn)[8]：瓣膜或瓣環(huán)厚度≥2.0～3.0mm，伴有回聲增強(qiáng)（回聲強(qiáng)度大于同切面主動(dòng)脈根部后壁回聲強(qiáng)度），瓣葉僵硬，活動(dòng)度減低，無瓣膜交界處粘連和融合。

1.2.3 eNOS基因多態(tài)性測(cè)定 BaiO-BE系列基因芯片檢測(cè)儀、BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀（上海百傲科技有限公司），PCR擴(kuò)增儀（德國(guó) Eppendorf AG 22331 Hamburg）。抽取受檢者肘靜脈血 2～3ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，充分混勻。

基因多態(tài)性測(cè)定方法同文獻(xiàn)[9]，低滲法裂解紅細(xì)胞，分離白細(xì)胞，飽和酚/氯仿法抽提白細(xì)胞基因組DNA，加Tirs-EDTA液（TE）溶解DNA，―20℃保存。利用PCR擴(kuò)增eNOS基因的特異片段，PCR反應(yīng)體系為25∶l，反應(yīng)條件為94℃熱啟動(dòng)5 min，再94℃變性25s，56℃退火25s，72℃延伸25s，反復(fù)40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min，進(jìn)而冷卻至4℃。在雜交倉(cāng)中將基因芯片與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻雜交，加入顯色溶液，后置于BaiO基因生物芯片識(shí)讀儀上檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果由圖像 Array Doctor軟件自動(dòng)分析生成，最后檢測(cè)出eNOS G894T多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間人群基因分布應(yīng)用 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，以P＞0.05表明樣本具有群體代表性。計(jì)量資料采用±s表示，組間均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。基因型及等位基因的頻率采用直接計(jì)數(shù)法，定性資料組間差異比較應(yīng)用c2檢驗(yàn)。采用二分類多因素logistic回歸分析各因素與SCVD之間的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 SCVD組與對(duì)照組之間基因頻率分布

對(duì)SCVD組與對(duì)照組中eNOS G894T基因型分布進(jìn)行基因多態(tài)性遺傳平衡檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，兩組的基因型分布符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P＞0.05），本研究選取樣本具有群體代表性。

2.2 基線特征比較

選取的132例瓣膜鈣化的受檢者中，65歲以上 9例，70歲以上 58例，80歲以上 59例，90歲以上6例；108例對(duì)照組中，65歲以上9例，70歲以上 56例，80歲以上 41例，90歲以上 2例。兩組年齡、男女比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組間有可比性。

SCVD組合并各瓣膜病變情況：?jiǎn)渭冎鲃?dòng)脈瓣鈣化69例（52.3%），主動(dòng)脈瓣合并二尖瓣鈣化53例（40.2%），單純二尖瓣鈣化10例（7.6%）。

2.3 SCVD組與對(duì)照組 eNOS G894T突變位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率

SCVD組GG基因型101例，GT基因型23例，TT基因型8例，T等位基因頻率14.8%；對(duì)照組GG基因型98例，GT基因型7例，TT基因型3例，G等位基因頻率94.0%。因?qū)φ战MTT基因型較少，故將GT與TT合并一項(xiàng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，SCVD組GT+TT基因型、T等位基因頻率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（基因型c2＝8.486，P＝0.004；等位基因c2＝9.425，P＝0.002；表1） 。

2.4 二分類多因素logistic回歸分析

將是否有瓣膜鈣化作為二分類因變量，eNOS G894T多態(tài)性、年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、高血脂病史、冠心病病史、糖尿病病史及血壓、血糖、血脂等作為自變量進(jìn)行逐步logistic回歸分析，結(jié)果顯示eNOS G894T多態(tài)性、TC、LDL-C、FBG水平、BMI、收縮壓水平以及高血壓病史、冠心病病史、高血脂病史均與SCVD相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），為SCVD的危險(xiǎn)因素。性別、吸煙、舒張壓水平、TG水平等，雖然兩組頻數(shù)或均數(shù)統(tǒng)計(jì)有差別，但經(jīng)logistic回歸分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不是SCVD的危險(xiǎn)因素（表2）。

3 討 論

隨著社會(huì)發(fā)展和人口老齡化，SCVD發(fā)病率逐年上升，更成為國(guó)外老年人群中（＞65歲）瓣膜置換的首要原因[1]。隨著我國(guó)人口老齡化，患病率也呈逐年上升趨勢(shì)，且隨年齡增長(zhǎng)而增加。劉麗等[2]在對(duì)北京地區(qū)軍隊(duì)老年人群SCVD的流行病學(xué)研究中提示：高血壓、腦卒中、高血脂、家族史是SCVD顯著的危險(xiǎn)因素。因此，對(duì)SCVD病因研究也已成為近些年心血管熱點(diǎn)之一。研究顯示，SCVD不僅是與年齡相關(guān)的不可逆退行性變，與機(jī)械壓力、內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)沉積、RAAS系統(tǒng)的激活、骨化反應(yīng)、鈣質(zhì)沉積等過程相關(guān)[10]。另分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制還與基質(zhì)金屬蛋白酶、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、Wnt、Nocth1信號(hào)通路等有關(guān)[11]。

表1 SCVD組與對(duì)照組eNOS G894T突變位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率Table 1 Comparison of eNOS G894T genotype and allele frequency between case group and control group

表2 SCVD組與對(duì)照組多因素logistic回歸分析Table 2 Binary logistic regression analysis

關(guān)于SCVD發(fā)病機(jī)制的探究近年來逐漸深入至基因水平。Probst等[3]在對(duì)法國(guó)西部地區(qū)流行病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，退行性主動(dòng)脈鈣化存在家族聚集性。這為SCVD可能為基因遺傳病提供理論依據(jù)。Novaro等[4]在對(duì)802位超聲診斷為鈣化性瓣膜病的患者分析中發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白E基因（apolipoproteinE，apoE）與SCVD相關(guān)，apoE2/4和apoE3/4基因型在鈣化性主動(dòng)脈狹窄（calcified aortic stenosis，CAS）中更為常見，apoE4等位基因是主動(dòng)脈狹窄的有意義的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，這一結(jié)果在校正年齡、性別、冠狀動(dòng)脈疾病、LDL-C等因素后仍有意義。Ortlepp等[5]的一項(xiàng)病例對(duì)照研究證實(shí)，維生素D受體基因多態(tài)性與CAS存在相關(guān)性，其中維生素D基因中的B等位基因在CAS患者中的基因頻率高于對(duì)照組。以上研究表明SCVD可能是一種與遺傳相關(guān)的疾病。

Simmons等[6]在對(duì)正常豬主動(dòng)脈瓣膜的組織病理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，與主動(dòng)脈瓣心室面相比，主動(dòng)脈面的內(nèi)皮細(xì)胞表型較多，且其分布程度與鈣化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。有報(bào)道稱，內(nèi)皮細(xì)胞參與到血管鈣化的啟動(dòng)過程中，血管鈣化時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞相互作用且對(duì)機(jī)械刺激、炎癥、代謝發(fā)生反應(yīng)，激活骨形態(tài)發(fā)生信號(hào)，這些因素相互作用，在骨髓導(dǎo)致骨礦化，在動(dòng)脈壁則導(dǎo)致血管鈣化[12]。以上研究提示，鈣化性心瓣膜病的發(fā)生可能與內(nèi)皮功能有關(guān)。一氧化氮合酶目前分為三種亞型：神經(jīng)型一氧化氮合成酶、誘生型一氧化氮合成酶iNOS、eNOS。其中eNOS主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，并在心血管疾病中具有重要作用。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在主動(dòng)脈瓣上同樣有eNOS的表達(dá)，其主要通過合成NO發(fā)揮擴(kuò)張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增生、抗血小板聚集和抗炎、抗氧化以及抑制血管緊張素Ⅱ等多種生物學(xué)作用[7]。eNOS基因多態(tài)性中，G894T等位基因攜帶者動(dòng)脈粥樣硬化的易感性高。本研究顯示，SCVD組eNOS G894T基因，GT、TT基因型頻率高于對(duì)照組，且T等位基因頻率高于對(duì)照組，提示eNOS G894T多態(tài)性可能與為SCVD的發(fā)病有關(guān)，其具體作用機(jī)制尚不清楚，可能與RAAS系統(tǒng)激活、炎癥-損傷反應(yīng)、NO保護(hù)作用減弱、Ca2+增加及脂質(zhì)的易沉積性等途徑相關(guān)。同時(shí)logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)eNOS G894T多態(tài)性、TC、LDL-C、FBG、BMI、收縮壓水平以及高血壓病史、冠心病病史、高血脂病史等因素為老年鈣化性心瓣膜病的相關(guān)危險(xiǎn)因素，與文獻(xiàn)報(bào)道大體一致[2,3]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，eNOS G894T多態(tài)性與SCVD關(guān)系密切。但是由于SCVD多為老年患者，存在多病性、不典型性等特點(diǎn)，該病影響因素較多，與其他心血管疾病存在交叉病理過程，臨床篩選病例統(tǒng)一性較差，以及人種差異等影響，目前關(guān)于SCVD的病因?qū)W研究存在一定爭(zhēng)議，對(duì)于該病基因?qū)W的相關(guān)研究還需有進(jìn)一步大樣本量的臨床流行病學(xué)研究證實(shí)，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)行更加詳細(xì)縝密的研究。

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